Monthly Archives: Agost 2018

Els bacteris làctics de les cerveses: els dolents i els bons

18 agost 2018

Click here for the English version: The good and the bad lactic acid bacteria of beers

No és fàcil “viure” a la cervesa

En principi, la majoria de bacteris làctics (BL), i molts altres bacteris i en general molts microorganismes, no ho tenen fàcil per sobreviure dins la cervesa, ni a d’altres begudes alcohòliques com el vi. Com és conegut, això és un dels motius principals pel qual vins i cerveses hagin estat des de l’antigor una de les maneres més segures higiènicament de beure una cosa semblant a l’aigua i que no estigués contaminada, a banda de les aigües bullides, com el té i altres infusions d’herbes.

Els motius de la difícil supervivència dels microorganismes a la cervesa són l’etanol, el pH força àcid (al voltant de 4), l’escassesa de nutrients degut a què els llevats els han assimilat quasi tots, el poc oxigen dissolt, l’alta concentració de carbònic (un 0.5% en pes/volum) i la presència dels compostos derivats de la humulona (Figura 1) del llúpol: els iso-alfa-àcids, fins a 50 ppm, que són microbicides. Tots aquests obstacles fan molt difícil que qualsevol microorganisme hi pugui prosperar. Les cerveses més susceptibles de creixement microbià no desitjat són les que algun dels obstacles o impediments esmentats està esmorteït: cerveses amb pH més alt de 4.5, o amb poc etanol o poc CO2, o amb sucres afegits -que són nutrients-, o amb poca quantitat dels compostos derivats del llúpol (Vriesekoop et al 2012).

 

Fig 1 512px-S-Humulone_Isomerization.svg

Figura 1. La humulona (esquerra) del llúpol es degrada durant l’elaboració de la cervesa a isohumulona (dreta) i altres iso-alfa-àcids, compostos amargs característics i microbicides (Wikipedia; Sakamoto & Konings 2003)

 

El pH àcid de la cervesa (lleugerament superior al vi) inhibeix molts dels bacteris patògens més coneguts (Figura 2). I els casos que veiem que podrien créixer a aquest pH a prop de 4, són inhibits pels altres factors com l’etanol.

Fig 2 Menz 2009 jib49-fig-0002-m

Figura 2. Marges de pH àcid per al creixement de diversos bacteris, comparat amb el pH típic de les cerveses. Tret de Menz et al (2009).

 

Els bacteris làctics dolents a la cervesa

Malgrat el que acabem de veure, alguns bacteris -concretament alguns dels làctics- han estat capaços d’adaptar-se evolutivament a les condicions estrictes de les cerveses, i hi poden sobreviure i espatllar-les. En concret, les espècies més freqüents com perjudicials per a la qualitat de les cerveses són Lactobacillus brevis i Pediococcus damnosus (Figura 3). La primera és la més freqüent, i pot donar gustos i aromes no desitjats, així com terbolesa al producte final. P. damnosus té l’avantatge de créixer a baixes temperatures, i pot produir també aromes no volguts, destacant-ne el diacetil (Vriesekoop et al 2012). Alguns Pediococcus i Lactobacillus poden adherir-se als llevats, induint que sedimentin, la qual cosa retarda la fermentació (Suzuki 2011).

 

Fig 3 brevis i pedio

Figura 3. Lactobacillus brevis (esquerra) i Pediococcus damnosus (dreta) al microscopi electrònic de rastreig.

 

Alguns Pediococcus també poden ser els responsables de l’aparició d’amines biògenes en algunes cerveses, amb risc per al consumidor. Les amines en certa concentració són tòxiques, poden ser presents en alguns aliments fermentats com formatges, embotits i begudes alcohòliques com vins i cerveses, i es produeixen per descarboxilació d’aminoàcids per part dels BL. El nivell de tiramina i altres amines ha estat utilitzat com a mesura de la qualitat en algunes de les cerveses belgues elaborades amb BL (Loret et al 2005).

A banda d’aquests BL, altres bacteris relacionats amb problemes de contaminació a les cerveses són els acètics com Acetobacter, típicament associats amb l’entrada d’oxigen  a l’envasat o a la distribució. Altres bacteris perjudicials són alguns enterobacteris, com Shimwellia pseudoproteus o Citrobacter freundii, que proliferen a les primeres etapes de fermentació, i produeixen butanodiol, acetaldehid i altres compostos aromàtics no desitjats (Vriesekoop et al 2012). Uns altres bacteris perjudicials per a la cervesa, sobretot un cop embotellada, són Pectinatus i Megasphaera, que són anaerobis estrictes, de la família dels clostridis, i poden produir sulfur d’hidrogen i àcids grassos de cadena curta, tots ells desagradables (Suzuki 2011).

 

Els bacteris làctics bons de les cerveses

Els BL són ben coneguts per ser uns dels microbis que més beneficis aporten al camp alimentari, per una banda com a mitjà econòmic de conservar els aliments, i per altra banda per millorar-ne la qualitat i les característiques organolèptiques. Per això són els principals agents dels aliments fermentats, junt amb els llevats. Hem vist alguns dels beneficis alimentaris dels BL en altres posts d’aquest mateix blog: els formatges prehistòrics, o la microbiota de la llet materna, i fins i tot els bacteris del vi.

Així doncs, els BL també tenen el seu bon paper a la producció de les cerveses: en concret, com veurem tot seguit, en la producció de malt acidulat, i en alguns estils peculiars de cervesa com les Làmbic de Bèlgica i la Berliner Weissbier.

Com sabeu, el malt és la matèria primera per fer cerveses. El cereal és sotmès al procés del maltatge, on els grans del cereal -ordi fonamentalment- es fan germinar, els enzims hidrolitzen el midó a sucres, i tot plegat es cou a continuació, obtenint-ne el most, que és la solució substrat per tal que els llevats fermentin i produeixin l’etanol i el carbònic. L’acidificació del malt, o sigui amb un pH més baix, té els avantatges d’activar molts enzims importants al maltatge, i donar una menor viscositat al malt i per tant a la cervesa final. Encara que l’acidificació es pot aconseguir afegint-hi àcids minerals o l’àcid làctic comercial, sovint es recomana o es legisla que l’acidificació sigui biològica, la qual s’aconsegueix afegint-ne BL. La utilització de cultius iniciadors de BL és un procés relativament nou i a més dels beneficis comentats sobre la qualitat del malt, s’ha demostrat que també inhibeix floridures no desitjades que són un problema real al maltatge i que poden donar micotoxines. Els compostos produïts pels BL que poden inhibir els fongs són el mateix àcid làctic i la baixada de pH conseqüent, algunes bacteriocines, peròxid d’hidrogen, i altres compostos no gaire coneguts com potser alguns pèptids (Lowe & Arendt 2004).

Les soques de BL més utilitzades per acidular el malt són de Lactobacillus amylolyticus aïllats prèviament del mateix malt. Aquestes soques de L. amylolyticus són moderament termòfiles, resistents als compostos derivats de l’humulona, i tenen l’avantatge de ser amilolítics a banda de produir l’àcid làctic, que baixa el pH (Vriersekoop et al 2012).

Les cerveses en la fermentació de les quals intervenen BL, com les d’estils Làmbic i Berliner Weissbier, pertanyen al tipus de cerveses de fermentació espontània. Els altres tipus de cerveses de fermentació controlada són, com sabeu, les més conegudes Ale i les Lager, ambdues inoculades amb llevats específics. Les Ale són les de fermentació alta, on el llevat Saccharomyces cerevisiae utilitzat tendeix a romandre a la superfície i la temperatura de fermentació és per damunt de 15ºC i de 20ºC. Les Lager són les de fermentació baixa, originàries històricament de Baviera, on el llevat S. pastorianus (syn. S. carlsbergensis) tendeix a dipositar-se al fons del fermentador i la temperatura és entre 7 i 13ºC.

 

Les cerveses belgues Làmbic

Les cerveses belgues tradicionals d’estil Làmbic (neerlandès lambiek o lambik) són les més conegudes en quant a les seves característiques sensorials degudes a l’activitat dels BL. Són tradicionals de Brussel·les mateix i de la regió veïna de Pajottenland, a la vall de riu Zenne, al Brabant flamenc al SW de la capital belga. Un dels pobles d’aquesta vall és Lembeek, que podria ser l’origen del nom d’aquesta cervesa.

Aquestes cerveses flamenques de fermentació espontània representen l’estil més antic de fer cervesa del món desenvolupat, des de fa uns quants segles. Des de fa pocs anys se n’elaboren cerveses semblants a altres països en petites quantitats, i als EEUU des de 2008 se’n produeixen en força quantitat, les anomenades “American coolship ales” (Ray 2014).

Les cerveses làmbiques s’elaboren amb malta d’ordi i un mínim de 30% de blat no maltejat. Al most s’afegeixen els cons d’un llúpol especial, totalment assecats i envellits durant 3 anys. S’hi afegeixen no tant per al seu aroma o amargor, que justament els envellits en tenen menys, sinó com a antimicrobià, per prevenir sobretot el creixement de bacteris patògens gram-positius al brou de fermentació.

També per evitar aquests contaminants i per afavorir la microbiota pròpia de la fermentació làmbica, aquestes cerveses només es produeixen entre octubre i maig, ja que a l’estiu hi ha massa microorganismes perjudicials a l’aire que podrien espatllar la cervesa, i cal baixar la temperatura després de la bullida. L’ebullició del most es realitza de forma intensiva, amb una evaporació del 30%. Després de la bullida, el brou es deixa en dipòsits oberts, i d’aquesta manera hi són adquirits els microorganismes de l’aire presents a les sales de fermentació de la cerveseria, normalment a la part alta de l’edifici, i de l’aire exterior, ja que la tradició diu que cal deixar les finestres obertes. Se suposa que la microbiota captada és específica de la vall del Zenne. Aquests dipòsits oberts són els koelschip en neerlandès (coolship en anglès), com piscines (Figura 4). En ser ben oberts, amb molta superfície (uns 6 x 6 m) i poca fondària (uns 50 cm), afavoreixen la captació dels microbis de la sala i de l’exterior. Una altra finalitat d’aquesta forma és el refredament més ràpid del brou bullit per iniciar la fermentació. Poden ser de fusta, de coure o d’inoxidable més recentment.

DCIM100GOPROGOPR0641.JPG

Figura 4. Koelschip (en neerlandès) o coolship (en anglès), els dipòsits oberts, com piscines, on s’inicia el procés de la cervesa Làmbic (Brasserie Cantillon, Brussel·les).

 

El brou “inoculat” d’aquesta manera espontània només es deixa una nit als koelschip, i l’endemà aquest most ja es bombeja a tancs de fermentació on hi serà un any, on el contingut en sucres va baixant, fins a uns 30 g/L. Després es transfereix a barriques de roure de les utilitzades prèviament per a xerès o porto, on es pot arribar a deixar uns dos anys més, a unes temperatures de 15-25ºC. Algunes barriques fa 100 anys que s’utilitzen les mateixes. El producte final és una cervesa tèrbola, d’un groc pàl·lid, amb molt poc carbònic, seca, àcida, amb uns 6-8º d’etanol, que recorda una mica al xerès i sobretot a la sidra, i amb un regust lleugerament agre (Jackson 1999).

En aquest llarg procés de fermentació, fins a 3 anys, com és lògic, hi ha una diversitat en la composició de la població microbiana. En una primera fase hi ha una certa predominança de llevats Kloeckera i sobretot d’enterobacteris durant el primer mes. Al cap de 2 mesos ja predominen Pediococcus damnosus i Saccharomycess pp. i comença la fermentació alcohòlica. Després de 6 mesos de fermentació el llevat predominant és Dekkera bruxellensis (Spitaels et al 2014), o el que és el mateix, Brettanomyces (Kumara & Verachtert 1991), del qual Dekkera és la forma sexual.

Fig 5 Spitaels fig3

Figura 5. Espècies dels aïllats en medis d’agar MRS i VRBG, sobretot enterobacteris i bacteris làctics, al llarg del procés d’elaboració d’una cervesa làmbic. El nombre d’aïllats és entre parèntesis (Spitaels et al 2014).

 

Veiem (Figura 5) com en concret a partir dels 2 mesos el bacteri predominant és el bacteri làctic P. damnosus. Aquest fou nomenat als primers estudis com “P. cerevisiae“, però aquest nom finalment no fou admès perquè incloïa altres espècies. El recompte d’aquests en MRS és de 10UFC per mL fins al final de la fermentació. L’acidificació sembla que té lloc ràpidament en la transició de la primera fase a la de maduració, coincidint amb el creixement de P. damnosus, que produeix làctic, encara que Dekkera/Brettanomyces i els bacteris acètics també contribueixen a l’acidificació (Spitaels et al 2014).

En altres assajos amb les American coolship ales (ACA) d’estil làmbic també s’han trobat Lactobacillus spp., i en un estudi metagenòmic (Bukolich et al 2012) amb aquestes ACA s’ha detectat DNA de diversos lactobacil·lals, i al final del procés també s’observa un predomini de Pediococcus (Figura 6, panell C). A la mateixa figura al panell A observem com el fong unicel·lular predominant també és Dekkera/Brettanomyces.

Fig 6 Bukolich fig 2

Figura 6. Anàlisis TRFLP (polimorfismes de longituds de fragments de restricció terminal amplificats per PCR) de DNA total extret de mostres del procés de fermentació de cerveses ACA (similars a les làmbic) durant 3 anys, utilitzant encebadors específics per a: llevats (ITS1/ITS4 del 26S rDNA, panell A);  bacteris (16S rDNA, panell B); i bacteris làctics (panell C). Les mostres senyalades amb * no donaren amplificació. (Bukolich et al 2012)

 

Cerveses derivades de les Làmbic: Gueuze, les afruitades i altres

La làmbic bàsica, tal qual, és difícil d’aconseguir, només es troba a uns pocs cafès de Brussel·les i de la zona de producció. De fet, és la base per elaborar les altres, molt més habituals de consumir:

La Faro és una làmbic endolcida amb sucre moré i a vegades amb espècies.

Les làmbic afruitades són les que se’ls ha afegit fruites senceres o xarop de fruites. Poden ser amb cirera agre (kriek), que són les més tradicionals, o amb gerds, préssec, raïm, maduixa, i en ocasions també de poma o pinya o albercoc o altres.

I finalment, les Gueuze, que són escumoses i fàcils de trobar per al consumidor. S’elaboren barrejant làmbiques joves (de 6 mesos a 1 any) amb altres làmbiques més madures (de 2-3 anys) en ampolles de vidre gruixut semblants a les de xampany o cava i es deixen per a una segona fermentació gràcies als sucres romanents del làmbic jove. Això ho hauria començat a fer un alcalde de Lembeek cap al 1870, que era propietari d’una cerveseria i hi va aplicar les tècniques de fermentació en ampolla que feia alguns anys havien donat bon resultat a la Xampanya (Cervesa en català 2012). La paraula gueuze pot tenir el mateix origen etimològic que gist (llevat en neerlandès) i també podria referir-se a que produeix bombolles del carbònic, o sigui, gas (Jackson 1999). Tanmateix, una altra versió històrica seria que a aquesta cervesa li deien “Lambic de chez le gueux” (làmbic de cal pobre) perquè l’esmentat alcalde de Lembeek tenia idees socialistes semblants a les del “Parti des Gueus” (partit dels captaires) que van fundar els calvinistes de Flandes al segle XVI per lluitar contra l’imperi espanyol. I com que cervesa és femení en francès, el femení de gueux és gueuze, vet aquí (Cervesa en català 2012).

En aquesta refermentació en ampolla es mantenen les poblacions de Dekkera/Brettanomyces i de BL, encara que apareixen en poca quantitat altres fongs unicel·lulars com Candida, Hansenula, Pichia o Cryptococcus (Verachtert & Debourg 1999).

Fig 7 lambics3 swanbournecellars

Figura 7. Diverses cerveses Gueuze i làmbic afruitades, majoritàriament belgues (Foto de www.swanbournecellars.com.au/).

 

La Berliner Weissbier (Figura 8) és una altra cervesa relativament semblant a les Làmbic. També és una cervesa feta amb una part important de most de blat, és tèrbola, àcida i amb un 3% d’etanol. És una clàssica de Berlín i el nord d’Alemanya, elaborada des del s. XVI i que fins a finals del s. XIX era la beguda alcohòlica més popular de Berlín, i que els soldats de Napoleó anomenaven el “xampany del nord”. En la fermentació espontània del most intervenen una barreja de Dekkera/Brettanomyces, Saccharomyces i lactobacils heterofermentatius.

Fig 8 Berliner Weissbier boozedancing_Fotor

Figura 8. La cervesa Berliner Weisse (tret de G-LO, @boozedancing wordpress).

 

Cerveses tipus làmbic fetes a Espanya

De la mateixa manera que recentment es fan les comentades American Coolship Ales, també se’n fan a molts altres països i en el cas d’Espanya, coincidint amb el gust per les cerveses artesanals, també se n’elaboren de tipus làmbic, sobretot de les afruitades. Segons el portal Birrapedia, actualment se n’elaboren 6 d’aquestes, totes de cireres, de les quals dues a les terres de Lleida, una a Barcelona, una a la Marina Alta d’Alacant, una a la vall del Jerte, i una altra a Astúries.

 

Resistència dels bacteris làctics de la cervesa als compostos del llúpol

Lactobacils i pediococs, tant els dolents com els bons que hem vist, i altres bacteris contaminants de les cerveses, tenen la capacitat de resistir els compostos del llúpol, que com hem vist són microbicides naturals. Aquesta resistència pot ser deguda a diversos sistemes de defensa, tant actius com passius (Sakamoto & Konings 2003). Els actius inclouen bombes d’eflux, com HorA i HorC, que transporten els iso-alfa-àcids (Figura 1) cap a fora la cèl·lula.  HorA ho fa amb despesa d’ATP, i HorC mitjançant la força motriu de protons (Figura 9). Els gens corresponents horA i horC foren trobats originalment a L. brevis, però després s’han trobat també a L. lindneri, L. paracollinoides i el més conegut P. damnosus (Suzuki et al 2006).

Curiosament, HorA mostra una semblança del 54% amb OmrA, un transportador de membrana d’Oenococcus oeni, relacionat amb la tolerància d’aquest bacteri del vi a l’etanol i altres factors d’estrés (Bourdineaud et al 2004) (Vegeu alguna cosa més sobre O. oeni al meu post sobre els bacteris de la vinya i el vi). Per tant, és probable que HorA tingui també funcions d’exclusió d’altres compostos a banda dels del llúpol. S’ha vist que aquests gens de resistència horA i horC i les seves regions flanquejants estan molt ben conservades i tenen les seqüències quasi idèntiques a les diferents espècies que les tenen; per tant, és molt probable que unes les hagin adquirit de les altres mitjançant transferència gènica horitzontal, per plasmidis o transposons, com és usual en molts altres bacteris (Suzuki 2011).

Fig 9 brevis Suzuki fig 8

Figura 9. Mecanismes de resistència als compostos del llúpol (Hop) a Lactobacillus brevis (Suzuki 2011).

 

Com veiem a la mateixa Figura 9, els protons entrats són bombejats a fora per una ATPasa, i el consum d’ATPs és compensat formant-ne gràcies al consum de substrats com citrat, malat, piruvat o arginina. Un altre mecanisme de resistència, passiu en aquest cas, és la modificació de la composició d’àcids grassos de membrana, amb la incorporació de més saturats, com el C16:0, disminuint la fluïdesa de membrana i dificultant l’entrada dels compostos del llúpol. Això també ens recorda els canvis de membrana a O. oeni relacionats amb la resistència a etanol (Margalef-Català et al 2016). La paret cel·lular també canvia la seva composició en presència dels alfa-iso-àcids del llúpol, augmentant-ne la quantitat dels lipoteicoic d’alt pes molecular, la qual cosa també faria de barrera. Veiem també (Figura 9) com els compostos del llúpol poden fer disminuir els nivells intracel·lulars de Mn2+, i aleshores s’observa una major síntesi de proteïnes dependents de Mn i una major captació de Mn2+ de l’exterior. Finalment, les cèl·lules de L. brevis quan són a la cervesa redueixen la seva mida (Figura 10), probablement per disminuir la superfície extracel·lular, i així minimitzar l’efecte dels compostos tòxics externs (Suzuki 2011).

Fig 10 brevis mida Suzuki

Figura 10. Efectes de l’adaptació a la cervesa (esquerra) en la mida de les cèl·lules de Lactobacillus brevis en comparació a les crescudes en medi ric MRS (dreta). Les barres fan 5 µm (Suzuki 2011).

 

Tots aquests mecanismes s’han estudiat a soques de L. brevis perjudicials de la cervesa, però se suposa que la resistència que també tenen els bacteris beneficiosos de les làmbiques i altres ha de ser deguda als mateixos mecanismes, ja que són de les mateixes espècies bacterianes.

Com a conclusió de tot el que he comentat, veiem que els bacteris làctics tenen uns papers destacables com a beneficiosos en diversos aspectes de la cerveseria i malteria, malgrat el seu paper més conegut de perjudicials en l’elaboració de les cerveses més habituals.

 

Bibliografia

Birrapedia (vist 18 agost 2018) Cervezas de tipo Fruit Lambic elaboradas en España. https://birrapedia.com/cervezas/del-tipo-fruit-lambic-elaboradas-en-espana

Bokulich NA et al (2012) Brewhouse resident microbiota are responsible for multi-stage fermentation of American Coolship Ale. PLoS One, 7, e35507

Bourdineaud J et al (2004) A bacterial gene homologous to ABC transporters protect Oenococcus oenifrom ethanol and other stress factors in wine. Int J Food Microbiol 92, 1-14.

Cervesa en català (2012) Fitxes de degustació – Timmermans Gueuze Tradition http://cervesaencatala.blogspot.com.es/2012/06/fitxes-de-degustacio-timmermans-gueuze.html

Jackson, Michael (1999) Belgium’s great beers. Beer Hunter Online, july 30, 1999

Kumara HMCS & Verachtert H (1991) Identification of Lambic superattenuating micro-organisms by the use of selective antibiotics. J Inst Brew 97, 181-185

Loret S et al (2005) Levels of biogenic amines as a measure of the quality of the beer fermentation process: data from Belgian samples. Food Chem 89, 519-525

Lowe DP & Arendt EK (2004) The use and effects of lactic acid bacteria in malting and brewing with their relationships to antifungal activity, mycotoxins and gushing: a review. J Inst Brew 110, 163-180

Margalef-Català et al (2016) Protective role of glutathione addition against wine-related stress in Oenococcus oeni. Food Res Int 90, 8-15

Menz G et al (2009) Pathogens in beer, in Beer in Health and Disease Prevention, (Preedy, V. R. Ed.), 403–413, Academic Press, Amsterdam

Ray AL (2014) Coolships rising: the next frontier of sour beers in the U.S.  First we feast 27 feb 2014

Sakamoto K & Konings WN (2003) Beer spoilage bacteria and hop resistance. Int J Food Microbiol 89, 105-124

Spitaels F et al (2014) The microbial diversity of traditional spontaneously fermented lambic beer. PLOS One 9, 4, e95384

Suzuki K et al (2006) A review of hop resistance in beer spoilage lactic acid bacteria. J Inst Brew 112, 173-191

Suzuki K (2011) 125th Anniversary Review: microbiological instability of beer caused by spoilage bacteria. J Inst Brew 117, 131-155

The Beer Wench (2008) My obsession with wild beers. Nov. 20, 2008 https://thecolumbuswench.wordpress.com/tag/lambic/

Verachtert H & Debourg A (1999) The production of gueuze and related refreshing acid beers. Cerevisia, 20, 37–41

Vriesekoop F et al (2012) 125th Anniversary review: Bacteria in brewing: the good, the bad and the ugly. J Inst Brew 118, 335-345

 

No sé ni cómo te atreves

Fotografía y esas pequeñas cosas de cada día

Pols d'estels

El bloc d'Enric Marco

Life Secrets

For my students

Horitzons llunyans

Mirades distants

#4wine

Los vinos son pequeñas historias dentro de una botella y nosotras queremos contarte las nuestras

Vi·moments·persones

Un maridatge a tres bandes

SciLogs: Artificial, naturalmente

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

microBIO

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

RealClimate

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

Quèquicom

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

Dionís de viatge a Ítaca

Experiències enoturístiques

%d bloggers like this: