Category Archives: Biotecnologia

Microbis domesticats per fer vi

24 agost 2022

A banda d’animals i plantes, els humans també hem anat “domesticant” alguns microbis al llarg de la història, en anar desenvolupant els aliments fermentats. Els grups principals d’aquests microorganismes són els bacteris làctics de molts productes lactis i vegetals fermentats, els llevats de les begudes alcohòliques, i les floridures d’alguns formatges i derivats de la soja. En aquest article, després d’una breu introducció, em limito sobretot als microbis del vi, o sigui, als llevats de la fermentació alcohòlica com Saccharomyces cerevisiae i als bacteris de la fermentació malolàctica com Oenococcus oeni.

DOMESTICACIÓ

Quan el flux genètic entre poblacions de la mateixa espècie es redueix, usualment per aïllament, l’evolució pot donar lloc a subpoblacions diferents, que eventualment poden esdevenir espècies diferents. Els humans poden interferir en aquest procés natural limitant el flux genètic deliberadament, seleccionant determinats trets desitjats, o sigui, la selecció artificial. D’aquesta manera, algunes espècies acaben essent dependents d’ambients antropogènics i adquireixen trets evolutius que interessen als humans. Això és la domesticació

Els trets buscats són molt diversos, des del rendiment (ex. ramaderia bovina o ovina o l’agricultura intensiva), passant per la tolerància al estrès (ex. collites resistents a sequera), fins arribar a l’estètica (ex. flors) o a la companyia (ex. gossos). Amb l’excepció dels gossos ja domesticats fa uns 30.000 anys, la majoria d’espècies domesticades ho foren durant la revolució neolítica fa uns 12.000 anys, amb el canvi de nomadisme de caçar i recol·lectar al sedentarisme lligat als conreus i al bestiar. En seleccionar els descendents d’animals i plantes que millor cobrien les necessitats específiques, aquests humans prehistòrics efectivament van començar a controlar els processos de selecció i el flux genètic (Steensels et al. 2019). 

DOMESTICACIÓ DE MICROORGANISMES

Comparat amb la de plantes i animals, la domesticació de microbis ha estat ignorada molt de temps. Recentment, el gran augment de dades genòmiques disponibles ha permès conèixer amb precisió les relacions genètiques entre diferents microorganismes, amb la qual cosa s’ha vist que els microbis industrials sovint representen branques genètiques diferenciades i aïllades als arbres filogenètics. Tanmateix, les circumstàncies ambientals que la domesticació microbiana requereix i les característiques genètiques concretes no s’han estudiat amb detall.

Curiosament, mentre que la domesticació d’animals i plantes són sobretot el resultat de l’esforç humà a posta, la domesticació dels microbis ha succeït sobretot sense intenció. Cal recordar que l’existència dels microorganismes començà a finals del s. 17 amb Antoni van Leeuwenhoek, el seu paper a les fermentacions no fou desvelat fins al s. 19 amb Louis Pasteur i altres, i sobretot els primers cultius purs, en concret de llevats cervesers, no foren obtinguts fins a finals del s. 19 per Emil C. Hansen a la Carlsberg.

Però és clar, les fermentacions són conegudes des del neolític o abans, encara que no se sabés res dels microbis com a tal. Un dels primers passos per controlar una mica el procés de fermentació fou probablement la retro-inoculació (backslopping en anglès), on s’utilitza material —i per tant microbis— d’una fermentació prèvia per començar-ne una de nova. Amb això, aquells antics artesans van promoure sense pretendre-ho l’adaptació dels microbis a l’ambient fermentatiu antropogènic, i per tant fou una selecció “inconscient”.

Al llarg del procés de domesticació dels microbis, hi ha una competència contínua entre diferents variants, ja siguin espècies, soques o mutants, a cada ronda de fermentació. O sigui, també hi ha una supervivència dels més adaptats, com a la selecció natural, encara que aquí és en un ambient controlat pels humans. En canvi, això ha canviat aquests darrers decennis des que s’utilitza la inoculació de cultius purs, seleccionats prèviament en base a les característiques volgudes. Aquesta selecció més “artificial” s’assembla més a la domesticació tradicional d’animals i plantes. La introducció de les noves eines biotecnològiques aquests darrers anys ha permès dissenyar encara millor el microorganisme amb les propietats desitjades per a la fermentació, incloent-ne algunes, com la producció d’aromes exòtics, que no necessàriament donen un avantatge adaptatiu del microbi.

Recomano la revisió de Steensels et al. (2019) per repassar les característiques del procés de domesticació als principals grups de microbis industrials, que són els bacteris làctics, els llevats i les floridures. Com he esmentat al principi, aquí em centraré sobretot en els relacionats amb el procés de vinificació, o sigui llevats i bacteris làctics, i per aquest ordre, de rellevància i temporalitat al vi.

DOMESTICACIÓ DELS LLEVATS

Els llevats són fongs unicel·lulars, i per tant microscòpics. Tenen uns 4 micròmetres de diàmetre, encara que alguns poden arribar fins a 40 µm, i ocasionalment alguns fan prolongacions o cadenes de cèl·lules conegudes com pseudohifes. Es reprodueixen sobretot asexualment per mitosi amb gemmació, una divisió asimètrica on el llevat fill més petit és la gemma. En condicions d’estrès poden esporular i després de la meiosi es produeixen espores haploides, que poden conjugar. La majoria són ascomicets però també n’hi ha de basidiomicets, i encara que hi ha unes 1500 espècies de llevats, el “llevat” per antonomàsia és Saccharomyces cerevisiae.

Encara que no exclusius del vi, els llevats S. cerevisiae són el model perfecte de domesticació microbiana perquè, malgrat ser eucariotes, tenen un genoma petit (12 Mb i 6500 gens, enfront la mitjana als ascomicets que és de 36 Mb i 11000 gens) i ben estudiat, temps de generació curts i es disposa de moltes eines per fer-hi recerca genètica i fenotípica.

S. cerevisiae només és abundant a les fermentacions de fruita recollida artificialment, com als raïms veremats un cop són al celler. En canvi, de forma natural s’ha trobat a molts hàbitats però en nombres escassos, i en particular a les fruites, al raïm mateix, i a l’escorça dels roure, que semblen ser els seus nínxols ecològics, però en qualsevol cas en nombres escassos (Steensels et al. 2019).

Per això s’ha proposat que S. cerevisiae no és que estigui adaptat a cap nínxol específic sinó que es pot dir que és una espècie nòmada, capaç de sobreviure com a generalista poc abundant en un ample ventall d’ambients. Pot sobreviure en molt diverses condicions i encara que el seu genoma és petit, és força complex i de fet per créixer als medis de laboratori només li calen el 20% dels seus 6500 gens (Goddard & Greig 2015).

Però malgrat no tenir clar quin és el seu hàbitat natural, està clar que el seu segon hàbitat són molts ambients artificials de fermentacions com les de pa, cervesa i viS. cerevisiae és conegut per les seves excel·lents característiques fermentatives, fins i tot en presència d’oxigen. Aquest caràcter sorgí com un procés evolutiu, adquirint la capacitat de créixer en medis amb molts sucres però amb pocs dels altres nutrients, i de convertir aquests diversos sucres a etanol, un compost antimicrobià per al qual aquest llevat és molt tolerant. El vi es considera la primera beguda fermentada alcohòlica, de fa uns 9000 anys (Fay et al. 2019). Amb tot, S. cerevisiae no és la única espècie per produir begudes alcohòliques, vins inclosos, ja que també ho són altres Saccharomyces relacionats: S. uvarumS. eubayanusS. kudriavzevii i altres derivats híbrids (González et al. 2006)

Com que l’etanol és un bon preservatiu natural enfront de microbis no desitjats, i addicionalment té la capacitat de ser una substància addictiva, la fermentació d’aliments per llevats va esdevenir una pràctica ben estesa, i va sorgir independentment en diverses civilitzacions arreu del món.

Per estudiar el probable origen de S. cerevisiae i la relació entre les seves diverses soques, en un estudi recent de seqüenciació i anàlisi dels SNPs (polimorfismes d’un sol nucleòtid) de més de 600 soques d’aquesta espècie (Duan et al. 2018) s’ha vist que les soques silvestres, de diversos continents però sobretot de la Xina, se separen quasi totes de les domesticades, excepte les aïllades en roures i altres Quercus, que són més properes als de les soques pròpies de vins i de cerveses (Figura 1). Com veiem, les soques domesticades es distribueixen en 2 branques evolutives. Una branca agrupa soques de fermentacions en estat sòlid, sobretot d’Àsia i en particular de la Xina. I l’altra inclou les pròpies de fermentacions líquides com els vins i les cerveses i altres, a més de les esmentades dels Quercus. Tot plegat, els autors (Duan et al. 2018) postulen un hipotètic origen de l’espècie, i sobretot de la seva domesticació, a la Xina o l’est asiàtic en general. 

Figura 1. Esquema de l’arbre filogenètic de soques de S. cerevisiae (adaptat de Steensels et al. 2019 i Duan et al. 2018).

Aquesta proximitat evolutiva de les soques de S. cerevisiae del vi amb les dels Quercus podria ser perquè aquests arbres fossin l’origen silvestre de les víniques o també perquè hi hagués hagut un retorn a la natura d’alguna soca vínica (Steensels et al. 2019).

Les soques de llevats domesticades dels diversos processos en estat líquid, o industrials “europees”, a més de ser diferents de les silvestres, s’agrupen filogenèticament força amb l’aplicació industrial, ja sigui cervesa o vi (Figura 2). Les soques domesticades de S. cerevisiae tenen reforçats uns trets que les fan idònies per a l’ambient fermentatiu, com l’adaptació a concentració alta de sucres, ambients amb poc O2 i tolerància a l’etanol, però també alguns trets específics del producte. Per exemple, els llevats cervesers poden metabolitzar maltotriosa, sucre específic del malt, mentre que els llevats vínics tenen una bona resistència als agents antimicrobians emprats, el sulfat de coure a la vinya i el sulfurós al celler. Com veiem (Figura 2), els S. cerevisiae del vi tenen una domesticació més limitada que els cervesers. Per exemple, els cervesers han perdut la capacitat de supervivència fora de l’entorn fermentatiu, mentre que els vínics poden esporular i sobreviuen a l’entorn extern. Això segurament és degut a que la fermentació del vi només passa un cop cada any, després de la verema, i la resta de l’any els llevats han de sobreviure al celler o a l’entorn en un ambient més natural (Steensels et al. 2019).

Figura 2. Filogènia i domesticació dels llevats industrials (Gallone et al 2016).

Cal afegir a aquestes diferències entre els llevats vínics i els cervesers, la molt més gran diversitat gènica dels llevats cervesers. De fet, molts d’aquests són S. cerevisiae, que inclouen els anomenats d’alta fermentació com els de les cerveses ale i stout i moltes més de tot el món, però justament les cerveses de baixa fermentació lager, que són el 94% del mercat mundial, són dutes a terme per S. pastorianus (sinònim S. carlsbergensis), per tant una altra espècie. Aquest S. pastorianus és un híbrid al·lotetraploïde de S. cerevisiae amb el llevat criotolerant S. eubayanus, i s’originà domèsticament cap al segle 15 a Baviera sotmetent les cerveses a baixes temperatures de coves dels Alps. Per això aquest llevat actua a 7-13ºC, i al fons del fermentador (Libkind et al. 2011). 

Totes les altres cerveses d’alta fermentació són elaborades amb molt diverses S. cerevisiae, constituint un grup polifilètic, amb moltes branques evolutives, algunes de les quals són filogenèticament properes a les del sake, del vi i del pa. La diversitat de nucleòtids dels S. cerevisiae cervesers és més del doble que la dels vínics. Aquesta major diversitat segurament és deguda a la suara comentada utilització estacional dels llevats vínics a diferència dels cervesers tot l’any, i també als més intensos i diferents règims de selecció associats a la seva elaboració (Gonçalves et al. 2016).

Amb tot això, tenim l’aparent paradoxa que les cerveses, com que la majoria de les consumides són lager, i moltes d’elles produïdes a gran escala industrial, semblen ser més estandarditzades comercialment i per tant més uniformes, i en canvi els vins semblen ser més diversos, en contra del que acabem de veure de la molt major diversitat de soques de llevats cerveseres que víniques. 

CANVIS GENÈTICS CAP A LA DOMESTICACIÓ DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE DEL VI

En centrar-nos en el vi, cal recordar que en començar la fermentació espontània del most de raïm les soques de S. cerevisiae no són predominants i hi ha un ampli espectre d’altres llevats, coneguts com no-Saccharomyces: Hanseniaspora, Pichia, Lachancea, Metschnikowia o Torulaspora i altres gèneres (Fleet et al. 1984). Per efecte de la producció d’etanol, S. cerevisiae acaba predominant i desplaçant en nombre a las no-Saccharomyces. Encara que cada cop més s’estan veient els beneficis d’aquests altres llevats a nivell d’aromes i s’estan utilitzant com a estàrters addicionals a S. cerevisiae (Jolly et al. 2014), no es pot parlar de la domesticació d’aquests no-Saccharomyces perquè no tenen fins ara un paper primordial en la vinificació, no es pot elaborar cap vi només amb aquests altres llevats. Per tant aquí em limitaré a S. cerevisiae

Molts dels mecanismes de canvis genètics que han portat a la domesticació de S. cerevisiae a la vinificació són presents també en altres espècies domesticades, tant microbianes com animals i plantes. El mecanisme més fàcil d’establir com a canvi genètic són els SNPs, degudes a mutacions puntuals d’un sol nucleòtid, però s’ha vist que aquests SNPs representen tan sols una petita fracció dels relacionats amb la domesticació de S. cerevisiae, i en canvi la majoria són rearranjaments estructurals del genoma, com els següents.

Les variacions en el nombre de còpies (CNV en anglès) són mutacions molt freqüents a molt diversos organismes, on fragments de DNA de > 1kb són repetits, tenen diverses còpies, amb nombre variable. El cas més conegut en els llevats vínics és el gen CUP1, que codifica per a una metal·lotioneïna, proteïna captadora de coure. Algunes soques poden tenir fins a 18 còpies d’aquest gen, amb la qual aquests S. cerevisiae vínics produeixen més quantitat de la proteïna i per tant són més tolerants al coure de la “barreja de Bordeus” usada com a fungicida a les vinyes (Steensels et al 2019).

Els rearranjaments cromosòmics, amb delecions, insercions o translocacions de grans fragments de cromosomes, sovint causades per transposons, són relativament freqüents en l’evolució dels llevats vínics i de Saccharomyces en general. De fet, aquests rearranjaments que poden afectar un nombre important de gens són una causa important de especiació. Un exemple n’és la tolerància al sulfit —l’antibacterià més usat en vinificació— degut a l’al·lel SSU1-R que és el producte sobreexpressat d’una translocació entre els cromosomes 8 i 16, només present als llevats vínics (Pérez-Ortín et al. 2002).

La hibridació interespecífica és un altre mecanisme de canvis que ja hem vist com a origen dels llevats domesticats a les cerveses lager. Les espècies de Saccharomyces poden hibridar molt fàcilment entre elles ja que aquests híbrids poden propagar-se per mitosi tan eficientment com els seus progenitors, encara que rarament poden fer la meiosi i per tant, quasi mai produeixen espores viables (Sipiczki 2008). Malgrat això, alguns dels llinatges híbrids poden acabar ser reconeguts com a espècies. Els casos més coneguts són l’esmentat S. pastorianus (sinònim S. carlsbergenesis) (S. cerevisiae x S. eubayanus) de les lager, i els S. bayanus (S. cerevisiae x S. eubayanus x S. uvarum) del vi (Figura 3). Tanmateix, S. bayanus és controvertit per les seves similituds amb S. cerevisiae i genera confusió de noms d’espècies amb alguna de les soques comercials més utilitzades (Sipiczki 2008).

Figura 3. Cladograma del gènere Saccharomyces amb les seves 8 espècies i 2 de les espècies híbrides, S. pastorianus i S. bayanusS. paradoxus inclou conjunts de soques originades a diferents continents. Modificat de Ono et al. (2020).

Els híbrids també han estat clau en l’aparició de força llevats vínics, sobretot en relació a la possibilitat de fermentar a baixes temperatures. Per exemple, algunes de les soques comercials d’estàrters que fermenten vi a 15ºC són híbrids “naturals” de S. cerevisiae amb S. kudriavzevii amb poliploïdia parcial, aïllats el 1979, que tenen la bona producció d’etanol de S. cerevisiae i la tolerància al fred de S. kudriavzevii (Erny et al. 2012).

De fet, recentment la hibridació interespecífica de diversos Saccharomyces vínics —per exemple S. cerevisiae x S. uvarum— s’està realitzant als laboratoris per tal d’aconseguir soques amb millors característiques relacionades amb caràcters poligènics. La hibridació com a mètode té l’avantatge de no ser considerada una tècnica GMO (organisme modificat genèticament, en anglès) i per tant les soques poden ser transferides ràpidament a la indústria (García-Ríos et al. 2019).

La transferència genètica horitzontal (TGH) és un altre mecanisme molt important evolutivament en molts organismes i en els llevats vínics també se’n coneixen alguns casos que han contribuït a la seva domesticació. Un cas és el gen Fsy1 codificant del transportador de fructosa, que permet a S. cerevisiae la utilització de la fructosa al final de fermentació, després d’haver consumit la glucosa. És molt probable que aquest gen li fou transferit del similar de S. pastorianus, per al que presenta molta homologia (Galeote et al. 2010). Un altre cas demostrat de TGH és el del gen Fot originari d’un altre llevat, Torulaspora microellipsoides, que li permet a S. cerevisiae una millor incorporació d’oligopèptids, que li donen avantatge competitiu quan les fonts de nitrogen són escasses (Marsit et al. 2015).

LLEVATS del VI DOMESTICATS o TORNEM ALS SILVESTRES ?

Malgrat els avantatges en la fermentació del vi que ha suposat l’ús d’aquests llevats evolucionats, això ha comportat una certa uniformització en les característiques del vi, sobretot a nivell d’aromes, perquè la majoria dels llevats utilitzats pertanyen a un sol llinatge genètic de S. cerevisiae domesticat. Com a contramoviment a això i també pel desig general de productes més “naturals” o ecològics, darrerament hi ha una tendència a utilitzar microorganismes silvestres i/o autòctons enlloc de les soques “domesticades”, o deixar més les fermentacions espontànies. Això passa amb el vi però també amb la cervesa i altres begudes i aliments fermentats (Steensels et al. 2014). En el vi, la tendència principal és sobretot l’ús de llevats no-Saccharomyces, presents de forma natural a l’inici de la fermentació, com he comentat abans, que donen perfils aromàtics diferents i molt interessants (Padilla et al. 2016). I encara més, els avenços en la comprensió de la domesticació combinats amb les noves tècniques disponibles per a l’evolució dirigida de microorganismes possibilitaran la creació de nous llinatges domesticats (Steensels et al. 2019).

———————–

DOMESTICACIÓ DELS BACTERIS LÀCTICS

El vi, juntament amb la cervesa i el pa, són els productes principals lligats a la domesticació comentada del llevat, S. cerevisiae bàsicament, amb algun altre molt relacionat com hem vist. Per tant, tenim unes poques espècies d’un sol gènere amb una gamma limitada de productes. En canvi, els bacteris làctics (BL) comprenen moltes espècies i ben diverses, que intervenen a molt diversos productes, tant derivats de la llet com de vegetals i d’altres aliments (Taula 1), molts més que els 3 bàsics dels llevats. Paradoxalment i tanmateix, al vi pràcticament només tenim una sola espècie de bacteri làctic domesticat, Oenococcus oeni, com tot seguit comentaré.

Els BL són bacteris gram-positius, de baix G+C al seu DNA, no esporulats, de metabolisme fermentatiu sense respiració, que produeixen àcid làctic com a producte principal de la fermentació de carbohidrats. Del punt de vista taxonòmic són l’ordre Lactobacillales, de la classe Bacilli, dins el fílum Firmicutes. Els seus hàbitats naturals són moltes plantes, especialment els fruits rics en sucres, i els animals, especialment els mamífers i entorn les seves llets, però també a l’interior dels seus cossos, com a la microbiota de boca i digestiu.

Els BL són el grup de microorganismes més important en la producció d’aliments i begudes fermentats, als que contribueixen en aroma, textura, seguretat i qualitat. La seva domesticació fou clau en la conservació d’aliments, i va resultar en molts cultius iniciadors per a la producció d’aliments industrials fermentats.

A nivell industrial, els productes làctics més coneguts són els lactis o derivats de la llet (Taula 1), on els BL predominants són Lactococcus i diversos gèneres actuals derivats de Lactobacillus (Zheng et al. 2020). En aquests dos grups, la domesticació va anar associada a pèrdua de gens de rutes biosintètiques —d’aminoàcids per exemple— i d’estrès oxidatiu, així com adquisició per TGH de gens per a un creixement òptim en l’ambient lacti, com els d’utilització de caseïna i de lactosa (Bonham et al. 2017).

Taula 1. Aliments (i begudes) fermentats amb intervenció de bacteris làctics (BL). Els BL o bacteris de l’àcid làctic (BAL, en anglès LAB) són de l’ordre Lactobacillales del fílum Firmicutes. Taula modificada i adaptada de Leroy & de Vuyst (2004). S’ha exclòs Bifidobacterium, que hi era a l’original, perquè no es dels Lactobacillales sinó del fílum Actinobacteria. S’han actualitzat els nous noms del gènere Lactobacillus (Zheng et al 2020).

Tipus de producteProducte fermentatBL predominants a, b
Productes lactisFormatges Lc. lactis, Le. mesenteroides, Lb. delbrueckii, Lb. helveticus, Lcb. casei, St. thermophilus
 Mantega i similarsLc. lactis, Le. mesenteroides
 IogurtLb. delbrueckii, St. thermophilus
 Altres llets fermentades cLcb. casei, Lb. acidophilus, Lcb. rhamnosus, Lb. johnsonii
 QuefirLnb. kefiri, Lb. kefiranofaciens, Lvb. brevis
Carns fermentadesEmbotits europeusLtb. sakei, Ltb. curvatus
 Embotits USAP. acidilactici, P. pentosaceus
Peix fermentatPlaa-som, bagoóng, garum i altresClb. alimentarius, C. piscicola
Vegetals fermentatsXucrutLe. mesenteroides, Lpb. plantarum, P. acidilactici
 OlivesLpb. pentosus, Lpb. plantarum, Le. mesenteroides
 Envinagrats: cogombrets, albergínies i altresLe. mesenteroides, P. cerevisiae, Lvb. brevis, Lpb. plantarum
 KimchiLe. mesenteroides, Le. kimchii, Ltb. sakei, Lpb. plantarum, W. kimchii, P. pentosaceus
 Salsa de sojaT. halophilus
Cereals fermentatsMassa mareFlb. sanfranciscensis, Lvb. brevis, Lpb. plantarum
Begudes alcohòliquesFermentació malolàctica del viO. oeni
 Vi d’arròsLtb. sakei
 Cerveses làmbic o similarsPediococcus spp.
Gèneres: C.=Carnobacterium, Lc.=Lactococcus, Lb.=Lactobacillus, Lcb.=Lacticaseibacillus, Lnb.=Lentilactobacillus, Lvb.=Levilactobacillus, Ltb.=Latilactobacillus, Clb.=Companilactobacillus, Lpb.=Lactiplantibacillus, Flb.=Fructilactobacillus, Le.=Leuconostoc, O.=Oenococcus, P.=Pediococcus, St.=Streptococcus, T.=Tetragenococcus, W.=Weissella.
b A banda de possibles altres microorganismes no BL
c Incloent les de probiòtics afegits

——————–

BACTERIS LÀCTICS DEL VI, OENOCOCCUS OENI I LA SEVA DOMESTICACIÓ

De la mateixa manera que amb els llevats, com que les fermentacions víniques no són estèrils, al most poden haver-hi molt diversos bacteris, incloent els BL. D’aquests, els més habituals durant la fermentació alcohòlica, si bé en nombres baixos —inferiors a 104 UFC/mL—, són Oenococcus oeniLactiplantibacillus plantarumLentilactobacillus hilgardiiLevilactobacillus brevisFructilactobacillus lindneriPediococcus parvulus i algun altre (Capozzi et al. 2021).

Però al final de la FA, quan el contingut d’etanol produït pels llevats ja és superior a 10% (v/v), aleshores la gran majoria de bacteris inclosos quasi tots els BL són inhibits, i pràcticament només hi romanen —i hi poden créixer lleugerament— les soques de O. oeni (Franquès et al. 2017), que duen a terme la fermentació malolàctica (FML) o conversió de L-màlic a L-làctic. Aquesta FML té els beneficis de reducció de l’acidesa, millora organolèptica i estabilitat microbiològica del vi (Bartowsky 2008). A banda de O. oeni, ocasionalment en alguns vins la FML pot ser duta a terme per altres BL, sobretot per Lpb. plantarum (Krieger-Weber et al. 2020).

Per tant, Oenococcus oeni és el bacteri del vi per excel·lència, degut a la seva tolerància a l’etanol i la capacitat de sobreviure en un medi àcid i amb polifenols i amb ben pocs nutrients com és el vi. La seva excepcionalitat està clar que va lligada a la seva domesticació —involuntària per als humans— i adaptació a aquest entorn artificial del vi durant aquests darrers milers d’anys.

CANVIS GENÈTICS CAP A LA DOMESTICACIÓ DE OENOCOCCUS OENI AL VI

Els bacteris gram-positius amb fermentació heterolàctica de sucres i forma de coc que realitzen la FML del vi foren classificats com Leuconostoc oenos per Garvie (1967) per la semblança amb altres Leuconostoc. Tanmateix, els del vi es distingeixen dels altres Le. pel creixement en medi àcid, la tolerància a l’etanol, i la pobre fermentació de carbohidrats, a més de les estructures diferenciades d’enzims clau com la D-lactat deshidrogenasa o la glucosa-6-fosfat deshidrogenasa. L’estudi filogenètic del gen 16S rRNA per Yang & Woese (1989) va revelar una línia ben diferenciada d’aquests bacteris del vi respecte a altres Leuconostoc i d’altres BL (Figura 4). Aquests autors ja observaren que la seqüència del 16S rRNA de “Le. oenos“, a més de ser molt distant de tots els altres Leuconostoc, tenia inusualment alterada la composició en posicions altament conservades. Per tot això Dicks et al. (1995) van proposar el nou nom de gènere i espècie Oenococcus oeni

Figura 4. Arbre filogenètic de O. oeni amb altres BL en base a les seqüències del gen 16S rRNA. Weissella, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus. Adaptat de Dicks et al. (1995).

Aquesta branca filogenètica ben llarga i diferenciada de O. oeni és indicativa de la ràpida evolució que aquest bacteri ha experimentat en la domesticació i adaptació al vi. Les característiques genòmiques principals d’aquesta espècie respecte a altres BL són d’una reducció gènica a tots els nivells (Makarova et al. 2006), la qual cosa es correspon amb la molt menor capacitat biosintètica (aminoàcids, vitamines, etc.):

  • El genoma de O. oeni és de 1.78 Mbp, el més petit dels BL, que van de 1.8 de diversos Streptococcus a 3.3 de Lpb. plantarum.
  • El nombre d’operons rRNA de O. oeni és 2, el menor de tots els BL, ja que alguns com Lb. delbrueckiii en tenen 9.
  • El nombre de tRNAs de O. oeni és 43, el menor de tots els BL, enfront de 55-98 dels altres, relacionat amb el menor creixement i la menor competitivitat ecològica.

A banda de la reducció gènica, a Oenococcus s’observen taxes més elevades de mutacions que a d’altres BL, és un gènere hipermutable (Taula 2). La causa és que hi són absents els gens mutS i mutL, que són gens de reparació d’errors d’aparellament (MMR, mismatch repair), mentre que aquests gens són presents a tots els altres BL. El tipus de mutacions més freqüent són les transicions (GC –> AT i AT –> GC). Això explica l’alt nivell de polimorfisme al·lèlic, que probablement va conduir a la seva adaptació als ambients àcids i amb etanol (Marcobal et al. 2008). L’alta mutabilitat devia generar algunes mutacions beneficioses per a ambients molt restrictius com és el vi, a diferència d’altres BL, com per ex. Leuconostoc o Pediococcus, que es troben en molt diversos hàbitats. A més, el gènere Oenococcus és un exemple de com la manca dels gens MMR pot portar a la especiació.

Taula 2. Hipermutabilitat de O. oeni respecte a altres BL (adaptat de Marcobal et al. 2008)

EspècieTaxes de mutació espontània amb rifampicinaTaxes de mutació espontània amb eritromicina% Transicions (GC-AT i AT-GC) / total mutacions
Oenococcus oeni1.6 x 10-61.6 x 10-683
Leuconostoc mesenteroides1.5 x 10-84.2 x 10-928
Pediococcus pentosaceus5.5 x 10-84.7 x 10-933

Aquesta hipermutabilitat ha originat la gran diversitat de soques de O. oeni que trobem en totes les regions vinícoles mundials, i quan s’estudien els seus genomes per diversos mètodes moleculars com els SNP (polimorfismes d’únic nucleòtid), s’observen (Figura 5) agrupacions de soques relacionades amb el tipus de producte, com les de xampany o de la sidra —on també és present aquest bacteri—, resultat de la domesticació-adaptació als diversos ambients on realitza la FML. També es troba O. oeni com a BL predominant a la kombutxa, la beguda de té fermentat per una comunitat de llevats, acètics i soques específiques de O. oeni i altres BL (Lorentzen & Lucas 2019).

Figura 5. Reconstrucció filogenòmica de soques de O. oeni en base als SNP (polimorfismes d’únic nucleòtid). Les soques procedents del mateix producte (sidra, xampanya) queden agrupades. Adaptat de Campbell-Sils et al. (2015).

OENOCOCCUS OENI, EL BACTERI DOMESTICAT QUASI NOMÉS PRESENT AL VI

Aquesta és potser l’evidència més clara de què O. oeni és un bacteri producte de la domesticació. De manera semblant al cas dels llevats i en aquest cas es pot dir que encara amb més certesa, és molt difícil trobar O. oeni fora del vi en ambients naturals. Les poblacions de BL al most de raïm són com a molt 104/mL, i O. oeni només és una petita part d’aquests. Hi ha molts pocs estudis on se’ls hagi pogut aïllar dels raïms o del most. En destaca el treball recent de Franquès et al. (2017) on s’aconseguiren aïllar-ne diverses soques al Priorat. Algunes d’aquestes foren també aïllades als mateixos vins, i es confirmà la presència del DNA d’O. oeni als mateixos raïms. 

Malgrat la minsa presència d’aquest bacteri als raïms i al most, un cop la fermentació alcohòlica està acabant i el vi conté una quantitat significativa d’etanol produït pels llevats, els pocs inicials O. oeni poden haver assolit unes poblacions suficients per realitzar la FML. A banda del most, també és molt probable que els bacteris ja hi siguin al celler, a les superfícies o interior dels equipaments, ja que s’han detectat soques comercials de O. oeni a cellers on se n’havia utilitzat anys abans (Lorentzen & Lucas 2019).

CONCLOENT, LA DOMESTICACIÓ INCONSCIENT DELS MICROBIS DEL VI HA GENERAT DOS MOLT EXCEPCIONALS

El llevat Saccharomyces cerevisiae és l’espècie principal implicada a la fermentació alcohòlica del vi, i el bacteri làctic Oenococcus oeni ho és per a la fermentació malolàctica. En canvi, abans de les fermentacions respectives quasi no hi són. Si no s’inoculen estàrters, els nombres de S. cerevisiae són molt baixos al most, i O. oeni pràcticament no apareix al vi fins al final de la fermentació alcohòlica. Per tant, es pot dir que si els humans no haguessin començat a fer vi —i cervesa en el cas dels llevats— fa alguns milers d’anys, aquestes dues espècies segurament no existirien. Són clarament microbis domesticats en el sentit que han aparegut evolutivament en un temps relativament breu com a derivats de microbis previs que no tenien les característiques específiques d’aquests dos.

Com hem vist, l’excepcionalitat de Saccharomyces (“el fong del sucre”), i en particular S. cerevisiae, és sobretot la capacitat de fermentar medis amb molts sucres, convertint-los a etanol en quantitats importants, per al qual aquest llevat és molt tolerant. Aquesta producció d’etanol és bioquímicament excepcional i única entre els fongs i els altres organismes. Vegeu al respecte el treball de Dashko et al. (2014) sobre l’evolució de la fermentació alcohòlica als llevats.

L’excepcionalitat d’O. oeni (“el coc del vi del vi”) també és ben evident. És una espècie “nascuda i modelada” al vi (Bech-Terkilsen et al. 2020), capaç de sobreviure en un medi ben hostil, amb etanol, pH baix i molt pocs nutrients. Hi subsisteix gràcies al L-màlic i algunes restes de les cèl·lules de llevats, com és el cas de les manoproteïnes (Balmaseda et al. 2021), i és resistent a l’estrès d’aquestes condicions extremes gràcies a algunes proteïnes protectores del xoc de l’etanol, als sistemes antioxidants com el glutatió (Margalef-Català et al. 2016), i també en part degut a l’acumulació de manganès —també antioxidant, i molt poc estudiat—, el qual a més és cofactor de l’enzim malolàctic (Makarova et al. 2006). Per tot això, O. oeni pot ser una espècie model d’estrès per als altres BL (Liu 2002).

BIBLIOGRAFIA

Balmaseda A, Aniballi L, Rozès N, Bordons A, Reguant C (2021) Use of yeast mannoproteins by Oenococcus oeni during malolactic fermentation under different oenological conditions. Foods 10, 1540

Bartowsky EJ (2008) Oenococcus oeni and malolactic fermentation —moving into the molecular arena. Aust J Grape Wine Res 11: 174-187

Bech-Terkilsen S, Westman J, Swiegers J, Siegumfeldt H (2020) Oenococcus oeni, a species born and moulded in wine: a critical review of the stress impacts of wine and the physiological responses. Aust J Grape Wine Res 26, 188-206

Bonham KS, Wolfe BE, Dutton, R.J. (2017) Extensive horizontal gene transfer in cheese-associated bacteria. Elife 6, e22144

Campbell-Sills H, El Khoury M, Favier M, Romano A, Biasioli F et al. (2015) Phylogenomic Analysis of Oenococcus oeni Reveals Specific Domestication of Strains to Cider and Wines. Genome Biol Evol 7, 1506–1518

Capozzi V, Tufariello M, De Simone N, Fragasso M, Grieco F (2021) Biodiversity of Oenological Lactic Acid Bacteria: Species- and Strain-Dependent Plus/Minus Effects on Wine Quality and Safety. Fermentation 7, 24

Dashko S, Zhou N, Compagno C, Piškur J (2014) Why, when, and how did yeast evolve alcoholic fermentation?. FEMS Yeast Res, 14, 826–832

Dicks LMT, Dellaglio F, Collins MD (1995) Proposal to reclassify Leuconostoc oenos as Oenococcus oeni [corrig.] gen. nov., comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 45, 395–397

Duan SF, Han PJ, Wang QM, Liu WQ, Shi JY et al (2018). The origin and adaptive evolution of domesticated populations of yeast from Far East Asia. Nat. Commun. 9, 2690

Erny C, Raoult P, Alais A, Butterlin G, Delobel P et al. (2012) Ecological Success of a Group of Saccharomyces cerevisiae/Saccharomyces kudriavzevii Hybrids in the Northern European Wine-Making Environment. Appl Environ Microbiol 78, 9

Fay JC, Liu P, Ong GT, Dunham MJ, Cromie GA et al. (2019) A polyploid admixed origin of beer yeasts derived from European and Asian wine populations. PLoS Biol 17(3): e3000147

Fleet GH, Lafon-Lafourcade S, Ribereau-Gayon P (1984). Evolution of yeasts and lactic acid bacteria during fermentation and storage of Bordeaux wines. Appl Environ Microbiol 48, 1034–1038

Franquès J, Araque I, Palahí E, Portillo MC, Reguant C, Bordons A (2017) Presence of Oenococcus oeni and other lactic acid bacteria in grapes and wines from Priorat (Catalonia, Spain). LWT Food Sci Technol 81, 326-334

Galeote V, Novo M, Salema-Oom M, Brion C, Valerio E et al. (2010) FSY1, a horizontally transferred gene in the Saccharomyces cerevisiae EC1118 wine yeast strain, encodes a high-affinity fructose/H+ symporter. Microbiology 156, 3754–3761

Gallone B, Steensels J, Prahl T, Soriaga L, Saels V et al (2016) Domestication and divergence of Saccharomyces cerevisiae beer yeasts. Cell 166, 1397–1410.e1316

García-Ríos E, Guillén A, de la Cerda R, Pérez-Través L, Querol A, Guillamón JM (2019) Improving the Cryotolerance of Wine Yeast by Interspecific Hybridization in the Genus Saccharomyces. Front Microbiol 9, 3232

Garvie EI (1967) Leuconostoc oenos sp. nov. J Gen Microbiol 48, 431–438

Goddard MR, Greig D (2015) Saccharomyces cerevisiae: a nomadic yeast with no niche ? FEMS Yeast Res. 15, 1–6

Gonçalves M, Pontes A, Almeida P, Barbosa R, Serra M et al (2016) Distinct Domestication Trajectories in Top-Fermenting Beer Yeasts and Wine Yeasts, Current Biology 26, 2750-2761

González SS, Barrio E, Gafner J, Querol A (2006) Natural hybrids from Saccharomyces cerevisiae, S. bayanus and S. kudriavzevii in wine fermentations. FEMS Yeast Res 6, 1221–1234

Krieger-Weber S, Heras JM, Suarez C (2020) Lactobacillus plantarum, a New Biological Tool to Control Malolactic Fermentation: A Review and an Outlook. Beverages 6, 23

Leroy F, De Vuyst L. (2004). Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry. Trends Food Sci Technol 15, 67–78

Libkind D, Hittinger CT, Valério E, Gonçalves C, Dover J et al (2011). Microbe domestication and the identification of the wild genetic stock of lager-brewing yeast. Proc Nat Acad Sci, 108(35), 14539-14544

Liu SQ (2002) A review: Malolactic fermentation in wine — Beyond deacidification. J Appl Microbiol 92, 589–601

Lorentzen MPG, Lucas PM (2019) Distribution of Oenococcus oeni Populations in Natural Habitats. Appl Microbiol Biotechnol 103, 2937–2945

Jolly NP, Varela C, Pretorius IS (2014) Not your ordinary yeast: non-Saccharomyce yeasts in wine production uncovered. FEMS Yeast Res, 14, 215–237

Makarova K, Slesarev A, Wolf Y, Sorokin A, Mirkin B et al. (2006) Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103:15611–15616

Marcobal AM, Sela DA, Wolf YI, Makarova KS, Mills DA (2008) Role of hypermutability in the evolution of the genus Oenococcus. J Bacteriol 190, 564-570

Margalef-Català M, Araque I, Weidmann S, Guzzo J et al. (2016) Protective roles of glutathione addition against wine-related stress in Oenococcus oeni. Food Res Internat 90, 8-15

Marsit S, Mena A, Bigey F, Sauvage F, Couloux A. et al. (2015) Evolutionary advantage conferred by an eukaryote-to-eukaryote gene transfer event in wine yeasts. Mol Biol Evol 32, 1695–1707

Ono J, Greig D, Boynton PJ (2020) Defining and Disrupting Species Boundaries in Saccharomyces. Ann Rev Microbiol 74,477-495

Padilla B, Gil JV, Manzanares P (2016) Past and future of non-Saccharomyces yeasts: from spoilage microorganisms to biotechnological tools for improving wine aroma complexity. Front Microbiol 7, 411

Pérez-Ortı́n JE, Querol A, Puig S, Barrio E (2002) Molecular Characterization of a Chromosomal Rearrangement Involved in the Adaptive Evolution of Yeast Strains. Genome Res 12, 1533-1539

Steensels J, Gallone B, Voordeckers K, Verstrepen KJ (2019) Domestication of industrial microbes. Curr Biol 29 R381 (Review) 

Sipiczki M (2008) Interspecies hybridization and recombination in Saccharomyces wine yeasts. FEMS Yeast Res 8, 996-1007

Steensels J, Snoek T, Meersman E, Picca Nicolino M et al (2014) Improving industrial yeast strains: exploiting natural and artificial diversityFEMS Microbiol Rev 38, 947–995

Yang D, Woese CR (1989) Phylogenetic structure of the ‘‘Leuconostocs’’: an interesting case of a rapidly evolving organism. Syst Appl Microbiol 12, 145–149

Zheng J, Wittouck S, Salvetti E et al (2020) A taxonomic note of the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostococaceae. Int J Syst Evol Microbiol 004107

Llicenciats en Biotecnologia per la URV, 10 anys després

21 febrer 2022

En memòria de l’Albert Almasqué, que fou alumne destacat de la 1a promoció d’estudiants de Biotecnologia de Tarragona. També fou el seu primer estudiant Erasmus (a Bolonya 2007-08), i coordinador de la 1a Jornada de Biotecnòlegs de Catalunya (abril 2010) de la ASBTEC.

Malauradament va morir l’agost de 2011. El recordem amb afecte.

MOTIUS D’AQUEST ARTICLE

El motiu principal ha estat la meva estreta relació amb aquestes noies i nois —actualment adults— que van estudiar la llicenciatura de Biotecnologia a la Universitat Rovira i Virgili (URV) a Tarragona, perquè vaig ser coordinador del disseny, elaboració i posta en marxa del pla d’estudis d’aquesta llicenciatura. A més a més, els vaig tenir a tots ells com a alumnes de 1 o 2 assignatures i vaig fer de tutor d’uns quants d’ells. Van ser 4 promocions, des dels que van començar el curs 2005-06 i van acabar pel 2009, fins als que van començar el curs 2008-09 i van acabar pel 2012, un total de 154 llicenciats. 

La meva relació prèvia amb els estudis de Biotecnologia va començar cap al 2001 quan vaig col·laborar amb el rector Lluís Arola en la documentació de la justificació, per part d’una comissió de rectors, de la llicenciatura en Biotecnologia com a títol oficial a nivell espanyol. També vaig col·laborar en la documentació de la justificació territorial i sòcio-econòmica a la URV. Un cop aprovada la implantació de la llicenciatura en Biotecnologia a la URV, el desembre del 2004 em van confiar l’encàrrec del disseny del pla d’estudis, que el vam elaborar en una petita comissió amb membres de les Facultats d’Enologia i de Química i de l’ETSEQ. En paral·lel, l’abril de 2005 vaig ser nomenat responsable de l’ensenyament de Biotecnologia.

Com a tal, durant aquells anys amb aquests alumnes, que van ser els “conillets d’índies“, vaig tenir l’honor i plaer de coordinar la posta en marxa de tots els cursos, els continguts de les assignatures, l’assignació als departaments, la concreció de les optatives, els itineraris o especialitzacions, la gestió dels projectes en empreses o institucions, les adaptacions i convalidacions amb els altres ensenyaments, l’establiment de convenis Erasmus amb altres universitats estrangeres, i l’adquisició d’equipaments als laboratoris i de fons bibliogràfics, entre altres coses. 

Tota aquesta feina la vam fer professors i administradors i tècnics de la Facultat d’Enologia —el centre responsable d’aquesta llicenciatura—, i sobretot amb professors dels Departaments més implicats: Bioquímica i Biotecnologia, Química Analítica i Q. Orgànica, Química Física i Inorgànica, Enginyeria Química i Ciències Mèdiques Bàsiques. Vull agrair a tots la seva confiança en el muntatge d’aquesta llicenciatura que vam muntar entre tots: alumnes, professors, personal tècnic i de gestió, i els responsables de la URV aquells anys.

Un segon motiu d’escriure aquest article és que aquests Biotecnòlegs són els únics amb la Llicenciatura, si més no a la URV, ja que la quarta promoció 2008-12 va ser la última, perquè el curs següent 2009-10, essent jo degà de la Facultat d’Enologia, va començar el Grau de Biotecnologia, amb la posada en marxa dels Graus universitaris. Per tant, i encara que els Graus tenen la mateixa validesa que les Llicenciatures —i la mateixa duració de 4 anys en aquest cas—, no deixa de ser com si s’hagués tancat un cicle d’estudiants que han compartit el mateix pla d’estudis i el mateix entorn de professorat i infraestructures. Per tant, d’alguna manera són únics i “extraordinaris”. Per descomptat, com que la nota de tall per accedir-hi era de les més altes —i ho segueix sent per al Grau—, eren ben espavilats i molt bons alumnes.

Cal senyalar que quan es va començar el 2005 aquesta llicenciatura a la URV, i coordinament amb la Universitat de Lleida, a Catalunya només es podia estudiar Biotecnologia a la UAB, i a la resta d’Espanya només s’havia iniciat a la Pablo Olavide de Sevilla. A banda, també s’havia començat en 2 universitats privades, la de Vic i la Francisco de Vitoria de Madrid. Per tant, era una llicenciatura ben nova, i a diferència de la llicenciatura de Bioquímica de 2n cicle —2 anys—, la de Biotecnologia ja fou de 1r i 2n cicle, amb els 4 anys. De fet, aquesta llicenciatura ja tenia moltes de les característiques dels Graus, i el canvi del pla d’estudis de Llicenciatura a Grau de Biotecnologia va ser relativament fàcil.

Posteriorment, amb els Graus des del 2010, la Biotecnologia ha tingut una expansió extraordinària, de tal manera que en l’actualitat només a Catalunya es pot estudiar a 7 universitats, sense comptar altres Graus relacionats. 

Un tercer motiu d’aquest article és donar una certa continuïtat a l’article que vaig escriure en aquest mateix blog a finals del 2012: https://abordons.wordpress.com/2012/09/28/els-biotecnolegs-per-la-urv-dos-anys-despres-fan-tesi-doctoral-o-treballen-al-sector/. En aquella ocasió vaig recórrer a fer una enquesta entre els que havien acabat un parell d’anys abans. Però a diferència de llavors, on només hi eren 2 promocions i feia molt poc temps que havien acabat, en aquest cas estic analitzant tots els biotecnòlegs que aquest curs farà entre 10 i 13 anys que van acabar la llicenciatura, o sigui, un nombre i un temps significatiu per veure com els ha anat i el que fan actualment.

QUI SÓN AQUESTS LLICENCIATS EN BIOTECNOLOGIA per la URV ?

Bé, no diré els noms, però aquí teniu les fotos dels actes festius de les 4 graduacions, on surten quasi tots.

Com he comentat, són 154, segons el que tinc apuntat dels llistats d’aleshores. Com és obvi a les fotos, són una gran majoria de dones, en concret 117 —un 76%—, i 37 homes —un 24%—(Figura 1).

Figura 1. Proporcions i nombres de llicenciades i llicenciats en Biotecnologia per la URV.

En quant al lloc d’origen o procedència d’aquests estudiants —encara que només ho tenia apuntat d’uns 115 dels 154—, una majoria són originaris de les comarques tarragonines (un 59%), n’hi ha un 19% de la resta de Catalunya (sobretot de l’àrea metropolitana de Barcelona), un 8% del País Valencià, un 3% de les Illes Balears i un 9% de la resta d’Espanya. D’aquests n’hi ha del País Basc, Aragó, Navarra, Galícia, Andalusia, Canàries, Castella-la-Manxa, i algun altre que no recordo. També hi ha un 2% originaris d’altres països, com Equador, Mèxic o Rússia. 

Cal senyalar que malgrat l’origen no catalanoparlant d’alguns d’ells —com veiem, un 11%—, i que una majoria de professors fem la docència en català, no va haver-hi mai problemes lingüístics, gràcies a la bona disposició i adaptabilitat per part d’alumnes i professors i a unes bones tutories específiques d’aquests casos. 

Quan van començar la llicenciatura, la gran majoria d’ells lògicament tenien 18 o 19 anys i la via d’accés havia estat les PAU des del batxillerat. Tanmateix, també hi hagué alguns que havien fet estudis de FP i ben pocs amb altres llicenciatures.

Molts d’ells van fer la llicenciatura de Biotecnologia en els 4 anys del pla d’estudis, però uns quants d’ells la van acabar en 5 anys perquè s’ho van combinar amb estades Erasmus o Sèneca i també amb el Projecte en empreses o institucions, així com simultaniejant amb la llicenciatura en Bioquímica.

Un aspecte interessant a comentar és la Menció o especialitat dins de Biotecnologia que van assolir aquests estudiants. En funció de les optatives que cursaven podien demanar una de les 3 mencions (Taula 1), que se’ls lliurava en forma de diploma en l’acte de graduació. Com veiem, una majoria important triaven la menció de Biomedicina.

Menció% Llicenciats
Biotecnologia Molecular i Biomedicina70
Biotecnologia, Aliments i Nutrició19
Biotecnologia Industrial i Medi Ambient11
Taula 1. Menció triada pels licenciats en Biotecnologia per la URV de les 4 promocions (total de 139 mencions)

…………………………..

MÈTODE EMPRAT PER OBTENIR LA INFORMACIÓ

Si bé jo ja disposava de la informació bàsica suara comentada de qui eren, l’interès d’aquest article és saber què han fet un cop van acabar la llicenciatura i de què o en què treballen actualment. Per aconseguir aquesta informació he recorregut sobretot al LinkedIn, la xarxa social orientada als professionals i els negocis més emprada mundialment, que té com a finalitat posar en contacte i establir col·laboracions entre professionals qualificats, i facilitar la cerca de feines. Actualment és propietat de Microsoft i té uns 750 milions d’usuaris. D’aquests 154 llicenciats en Biotecnologia, 137 són usuaris de Linkedin i els apartats de continguts que la gran majoria d’ells tenen actualitzats i que he pogut aprofitar són lògicament sobretot els d’Experiència i d’Educació. 

Per aconseguir informació dels altres que no són a LinkedIn o quan la informació d’aquest no ha estat suficient, he recorregut a les cerques de Google, i és clar als seus e-correu si els tenia, o gràcies a consultes que he fet a algun/a dels altres companys. Dels 154, finalment he aconseguit prou informació de 151 i per tant només n’hi ha 3 dels qual no he trobat res. Amb això, crec que els resultats són ben significatius, d’un 98% del total de llicenciats en Biotecnologia per la URV.

Amb tota aquesta informació he elaborat un full de càlcul Excel (que no mostro aquí) amb 154 files i unes 30 columnes de dades de tots ells, que per analitzar-les poden ser ordenades amb filtres de cada columna. A partir d’aquí en un altre full de càlcul he pogut confeccionar i analitzar els resultats de cada tipus de dades i elaborar els gràfics corresponents.

MÀSTERS I ALTRES ESTUDIS FETS 

Com he dit, alguns van simultaniejar l’acabament de la llicenciatura de Biotecnologia amb la matriculació a la de Bioquímica de 2n cicle a la mateixa URV (a la Facultat de Química), ja que hi havia una part important de compatibilitat entre ambdós ensenyaments. En concret, els que ho van fer van ser un 14%, dels quals la majoria són de les primeres promocions: del 2009 (un 19% també van fer Bioquímica) i del 2010 (un 28%).

En quant als Màsters, un 82% d’aquests llicenciats en Biotecnologia n’han cursat algun. De fet, aquests 127 han realitzat un total de 160 Màsters, o sigui, una mitjana de 1.26 Màsters per persona, ja que 25 d’ells han fet 2 Màsters, i fins i tot n’hi ha 4 que han fet 3 Màsters.

Com veieu (Figura 2), els Màsters realitzats són molt diversos. N’hi ha uns 35 de matèries o àmbits bàsics o complementaris de disciplines ja estudiades una mica a la llicenciatura, com Biotecnologia, Bioquímica i Biologia Molecular, Genètica, Immunologia, Microbiologia, Enginyeria Bioquímica o Bioinformàtica. A banda d’aquests bàsics, la Biomedicina és l’àmbit preferit —com era previsible havent vist les seves preferències que hem comentat abans amb les Mencions dins la llicenciatura—, amb un total de 53 Màsters dels 160, incloent-ne d’aspectes diversos, com Ciències Mèdiques, Farmacologia, Neurociències, Psiquiatria, Reproducció humana, Clínica, Forense i altres.

Figura 2. Distribució en àmbits i nombres dels 160 Màsters realitzats per 127 llicenciats en Biotecnologia per la URV.

Un altre àmbit amb força Màsters realitzats és el de Nutrició, Enologia i altres relacionats amb aliments, on també he inclòs alguns de vegetals. Entre aquests estan els Màsters concrets més cursats de tots els tipus: Nutrició i Metabolisme (12) i d’Enologia (9), impartits al mateix campus de Sescelades de la URV.

Els Màsters de Professorat són també dels més cursats (19), ja que són requerits per impartir classes a educació secundària. Després hi han els Màsters relacionats amb Medi Ambient, biodiversitat i sostenibilitat (8). Cal destacar també els Màsters relacionats amb Finances, negocis i màrqueting (6). Un altre tipus de Màsters ben novedosos i específics bastant cursats són els de Nanociència i nanotecnologia (6). Finalment, alguns d’aquests llicenciats han cursat Màsters relacionats amb altres àrees (5) com per exemple Comunicació, Riscos laborals, etc.

La diversitat dels Màsters realitzats també es reflexa en els llocs on han estat cursats (Figura 3). La gran majoria són Màsters oficials realitzats a les universitats públiques (95%). Malgrat que molts els han realitzat a la mateixa URV (30%), cal destacar que la proporció més gran (37%) els han fet a l’àrea de Barcelona, sobretot a la UB, UAB i UPF. La majoria de valencians d’origen, però també algun altre, han optat per realitzar Màsters d’universitats de València i Alacant (8%). A més dels senyalats de Madrid, País Basc i Navarra, també n’han fet a diverses universitats de la resta d’Espanya (Salamanca, Saragossa, Logronyo, Sevilla, Granada i Vigo). Lògicament els Màsters de negocis o màrqueting han estat fets a centres privats com el CESIF, ESADE o IUCT, sobretot de Barcelona. Els Màsters realitzats a la resta d’Europa ho han estat a Dinamarca (4), Alemanya (3), Regne Unit (2), Països Baixos, Suècia i Finlàndia.

Figura 3. Distribució i nombres dels llocs de realització dels 160 Màsters realitzats per 127 llicenciats en Biotecnologia per la URV.

A nivell de postgrau, a banda d’altres cursos diversos que molts d’ells han realitzat, cal esmentar la superació de l’examen per tenir una plaça de BIR (Biòleg Intern Resident). És la formació sanitària especialitzada de 4 anys per a biòlegs, bioquímics i biotecnòlegs, que dóna el títol de Biòleg Especialista a nivell de tot Espanya, per poder treballar com a tal en hospitals públics o privats, de forma similar als MIR dels metges. Segons la informació de què disposo, només n’hi ha hagut una dels nostres llicenciats que va superar aquest examen i aconseguí una plaça de resident especialista, concretament en Immunologia. És una llàstima que aquesta possibilitat, ben factible i atractiva, no és gaire coneguda entre els nostres biotecnòlegs.

TESIS DOCTORALS

Entre aquests llicenciats en Biotecnologia per la URV, n’hi ha 87 que ja són Doctors, un 56%. Aquest % és molt semblant en les 4 promocions (un 55-59%). Els àmbits o àrees de les tesis doctorals són molt similars als comentats dels Màsters, amb un clar predomini dels temes de Biomedicina i lògicament molt diversos i específics segons els grups de recerca on els han realitzat. El resum dels llocs de les universitats o altres centres de recerca on han fet les tesis doctorals són els que veiem a la Figura 4.

Figura 4. Resum dels llocs de realització de les tesis doctorals dels 87 Doctors, també llicenciats en Biotecnologia per la URV.

Com veiem, la proporció dels que han fet la tesi doctoral als departaments de la URV (Dpt. Bioquímica i Biotecnologia, Dpt. Ciències Mèdiques Bàsiques i Dpt. Enginyeria Química) és més gran que la dels Màsters cursats a la URV. Lògicament i en línia als Màsters, molts han fet la tesi a les universitats o altres centres de recerca de Barcelona. Els 8 que l’han fet a la resta d’Espanya han estat al País Valencià (4), País Basc, Vigo, Sevilla i Madrid. 

Cal destacar el nombre elevat (18) de tesis realitzades a la resta del món, un 21%, molt més que la proporció de Màsters fets a fora (8%). Els països on s’han fet aquestes tesis són Regne Unit (4 tesis), Alemanya (3), Països Baixos (2), Suècia (2), Suïssa, Itàlia, Txèquia, Finlàndia, Estats Units, Mèxic i Austràlia.

Curiosament, el nombre de tesis realitzades a la URV fou molt més gran dels que van acabar el 2009 (14) que la resta d’anys, i en canvi, de les tesis realitzades a l’estranger només en fou una el 2009 i es disparen a la darrera promoció de 2012 amb 9 tesis, la meitat de les 18 totals.

ON SÓN ACTUALMENT aquests LLICENCIATS EN BIOTECNOLOGIA per la URV ?

He trobat informació d’on són i/o treballen actualment de 150 dels 154 llicenciats en Biotecnologia que tinc apuntats. Cal fer constar que aquí i als apartats següents comento on són actualment, però que molts d’ells durant aquests 10-13 anys transcorreguts han passat per diferents llocs i dedicacions. Per exemple, alguns dels que ara són a Catalunya o la resta d’Espanya abans han estat fent les tesis doctorals o altres estades en altres llocs, molts de l’estranger. Bastants han fet Màsters en un lloc i la tesi en un altre, i han tornat a llocs més propers al seu origen, o en algun cas, ben a l’inrevés.

Com veiem (Figura 5), lògicament els llocs on treballen ara són sobretot Tarragona i comarques tarragonines (32%) i la resta de Catalunya (29%), sobretot a l’àrea metropolitana de Barcelona. De la resta d’Espanya destaca Madrid, el País Basc i Navarra, i el País Valencià. Com veiem, és remarcable la proporció dels que són a l’estranger, un 26%. D’aquests, veiem a la part inferior de la Figura 5 els que són als diversos països d’Europa. Entre aquests en són majoria els països del nord, i és curiós que no n’hi ha cap ni a França ni a Itàlia. 

Figura 5. Distribució dels llocs de treball actuals dels llicenciats en Biotecnologia per la URV. A la part inferior, la distribució de llocs dels que són a la resta d’Europa.

A fora d’Europa hi ha lògicament la majoria als Estats Units (5), i alguna a Mèxic, Equador, Austràlia (2) i fins i tot una a Singapur. Utilitzo el femení en aquests casos perquè totes aquestes 10 que són fora d’Europa són dones. I entre els que són a la resta d’Europa es manté la proporció aproximada de 3/4 de dones i 1/4 d’homes que hem vist del total de llicenciats. Per tant, no podem dir que en aquest cas els homes hagin estat més “aventurers” marxant ben lluny de casa que les dones, potser ha estat al revés.

Entre els que no són a l’estranger, com era d’esperar, hi ha una certa correlació amb el lloc d’origen, que és més clara per als de les comarques tarragonines, els valencians, balears, aragonesos, bascos i navarresos. No hi tanta correlació amb el lloc d’origen en els casos de Barcelona i sobretot Madrid, on hi van a treballar també d’altres llocs degut a la concentració d’empreses i institucions.

EN QUÈ TREBALLEN ACTUALMENT els LLICENCIATS EN BIOTECNOLOGIA per la URV

Dels 154 llicenciats apuntats he trobat informació de 149 en quant a l’àmbit i tipus de feina que fan. Com veiem a la Figura 6, només hi ha 10 que treballin amb temes no relacionats amb Biotecnologia. O sigui, un 93% dels llicenciats (139) treballen en àmbits o temes més o menys relacionats amb Biotecnologia, entenent aquesta en un sentit ample. 

D’aquests 10 que no treballen en Biotecnologia, n’hi ha alguns tècnics d’empreses del sector químic, altres responsables de màrqueting i negocis en diverses empreses, i algun dissenyador de webs i redactor de blogs, entre altres. Els casos més sorprenents d’aquests altres, que demostren la pluralitat de formació de moltes persones incloent les vocacions artístiques, són una soprano del Liceu de Barcelona i una actriu de teatre, cine i TV. Molt d’èxits a les dues !!

Una ampla majoria dels 149 llicenciats (58% de tots, i un 62% dels que treballen en àmbits de Biotecnologia) ho fan en temes relacionats amb Biomedicina i temes relacionats amb la salut (Figura 6 part superior).

A la part inferior de la Fig. 6 veiem una distribució aproximada dels temes dins de Biomedicina. El grup més nombrós (28%) són els que estan en temes de gestió, negocis, comercials o de mercat. Els segueixen (14%) els que he agrupat com a òmiques i bioinformàtica incloent els que treballen en genètica humana. La meitat d’aquests 10 són de bioinformàtica. A la resta de les columnes de la Figura veiem altres àmbits específics destacables com l’Embriologia i reproducció humana o la Immunologia i vacunes. En el cas de Microbiologia i fongs n’hi ha alguns relacionats amb control de qualitat i altres amb recerca. Cal remarcar el nombre significatiu dels que treballen en temes ben específics com Càncer (5) o les Neurociències (4).

Entre els altres àmbits (Figura 6, part superior) veiem un 7% que treballen en empreses d’Anàlisi i diagnosi, de reactius i equipaments que s’utilitzen tant a l’àmbit biomèdic com alimentari i altres. Un 12% estan relacionats amb el camp Alimentari, on he inclòs alguns de temes agrícoles i d’animals, així com els que fan recerca en llevats, que és aplicable tant al camp alimentari com el biomèdic. Al camp Ambiental i temes d’aigües residuals o de consum s’hi dediquen un 4%. Al sector Educatiu hi són un 10%, sobretot com a professors de secundària. Finalment, uns poquets (2%) treballen en temes de Bibliometria i gestió universitària de Transferència de la recerca.

Figura 6. Distribució dels àmbits de feines actuals dels llicenciats en Biotecnologia per la URV. A la part inferior, distribució dels que treballen en Biomedicina i altres temes relacionats.

Un altre aspecte per considerar és en quin tipus d’institució o empresa i en quin sector treballen (Figura 7). Com veiem, un 4% ho fan en organismes de l’administració, en concret 3 de la Generalitat de Catalunya i 2 de la Unió Europea. A les universitats és on més n’hi ha (19%), dedicant-se majoritàriament a la recerca, sobretot amb contractes postdoctorals. Entre aquests, n’hi ha uns 4 professors a temps complet i com a mínim 3 associats. 

El 10% dels llicenciats s’han immers en el món de l’ensenyament secundari. D’altra banda, un nombre important (quasi un 19%) són en centres de recerca, dels quals la majoria són públics i només un és un centre privat. Alguns (6%) treballen en centres de salut, com els d’embriologia i reproducció assistida. Totes aquestes institucions majoritàriament públiques representen el 55% dels casos.

En quant als que treballen en empreses i altres centres privats (Figura 7, columnes marrons, dreta), són el 45%. Les més freqüents són les empreses farmacèutiques (17%), seguides de les de productes de laboratori, on incloc els productes d’aplicació biomèdica (10%). També hi ha un 4% que treballen en empreses del camp de la salut, diferents de les farmacèutiques. D’altra banda, els de les empreses agroalimentàries, incloent alguna de nutrició animal, representen el 8% del total. Hi ha un 3% en empreses de temes ambientals i finalment un 1% en una empresa d’informació de publicacions científiques.

Figura 7. Distribució en funció dels tipus d’institucions o empreses i sectors de les feines actuals dels llicenciats en Biotecnologia per la URV. En blau els centres públics i en marró les empreses i altres centres privats.

Per acabar aquest apartat, em queda comentar quin tipus de feina o contracte o càrrec tenen els 139 llicenciats que treballen en temes de Biotecnologia, independentment de l’àmbit, biomèdic o alimentari o el que sigui. Tanmateix, aquests tipus de feines són molt relatius, i aquí m’he basat exclusivament en el que ells mateixos fan constar al Linkedin. 

Per fer això, en primer lloc considero separadament els que treballen en el sector públic dels que ho fan en empreses privades.

Els tipus de feina dels del sector públic es poden resumir aproximadament en aquests 4 (Taula 2):

Investigadors i professors d’universitat a temps complet65%
Professors de secundària (algun a la privada)16%
Tècnics especialistes (en bioinformàtica, immunologia, anàlisi, etc.) 13%
Responsables de projectes, estratègies, consultories, etc. 6%
Taula 2. Tipus de feina actual dels llicenciats en Biotecnologia per la URV que treballen al sector públic.

Entre els que són al sector privat (Figura 8) hi ha un 9% que es podrien dir tècnics de gestió, incloent temes de logística, comercial, màrqueting i regulació. D’aquests mateixos temes hi ha un 8% que són caps d’alguna secció. Un altre 15% són caps de planta o de projecte. 

Entre els que treballen com a tècnics, encara que és difícil fer classificacions, es pot dir que n’hi ha un 8% relacionats amb temes de qualitat, sobretot de control microbiològic. Hi destaquen els tècnics de I+D en diversos temes (35%) i d’altres es poden agrupar com a tècnics especialistes (9%), en immunologia i embriologia sobretot. Alguns d’aquests tècnics també fan tasques de recerca. Finalment, tenen contractes com a investigadors un 11%.

Figura 8. Distribució dels diversos tipus de feines o contractes o càrrecs de les feines actuals dels llicenciats en Biotecnologia per la URV que treballen en empreses o altres centres privats.

Amb això, si ajuntem els tipus de feina, tant al sector públic com el privat, aproximadament tenim aquesta distribució de tots ells (Taula 3):

Investigadors i professors d’universitat a temps complet40%
Tècnics I+D, de qualitat i especialistes31%
Responsables de projectes, de planta, de consultories o d’altres14%
Professors de secundària 9%
Tècnics en gestió, comercial, mercat, regulació i altres 6%
Taula 3. Tipus de feina actual dels llicenciats en Biotecnologia per la URV.

…………………………….

CONCLUSIONS

Em sembla que aquests 10 anys transcorreguts des què van acabar la llicenciatura són suficients per veure quin és el seu assoliment com a professionals. Són joves ben cert, i encara tenen moltes possibilitats de futurs èxits, però la primera impressió és que el nivell global aconseguit en aquests anys és molt bo, la gran majoria s’han seguit formant científicament amb postgraus i molts amb tesis doctorals, i la majoria d’ells treballen en temes relacionats amb biotecnologia, i sobretot, treballen dignament, cosa que avui dia no és gens fàcil.

Amb el que hem comentat, les principals conclusions de forma resumida d’aquest article són:

  1. Els llicenciats en Biotecnologia per la URV, de les 4 promocions (2005-2009 a 2008-2012), són una gran majoria de dones, 76%.
  2. Els resultats aquí mostrats són ben representatius de tots els llicenciats en Biotecnologia per la URV, ja que corresponen a la informació d’uns 151 del total de 154, o sigui, un 98%.
  3. Un 82% d’aquests llicenciats han realitzat algun Màster, i uns quants d’ells més d’un.
  4. Els àmbits majoritaris dels Màsters realitzats són Biomedicina (33%), matèries bàsiques complementàries (21%), Nutrició, Enologia i Aliments (18%) i Professorat (12%).
  5. El 95% de Màsters realitzats han estat en centres públics, sobretot a l’àrea de Barcelona (37%), seguits de la URV (30%), les universitats valencianes (8%) i a altres països d’Europa (8%).
  6. Un 56% dels llicenciats han fet la tesi doctoral i ja tenen el títol de Doctor. Els àmbits principals són semblants als dels Màsters, predominant també els temes relacionats amb Biomedicina.
  7. La tesi doctoral l’han realitzat majoritàriament a la URV (38%) i a l’àrea de Barcelona (32%). Cal destacar que un 21% l’han feta a l’estranger.
  8. Actualment treballen sobretot a Tarragona i comarques (32%) o a Barcelona i resta de Catalunya (29%). Cal destacar que un 26% són a l’estranger, la majoria d’ells a Europa, sobretot als països nòrdics. Curiosament, totes les 10 (6%) que són fora d’Europa són dones.
  9. La gran majoria d’aquests llicenciats treballen en àmbits relacionats amb la Biotecnologia (93%). Un 58% dels llicenciats ho fan en temes de Biomedicina. Altres àmbits rellevants són l’Alimentari (12%) i l’Educació (10%).
  10. Les institucions públiques on treballen són més de la meitat (55%), sobretot les universitats i centres de recerca, a més del centres d’ensenyament secundari. El tipus de feina majoritari que fan dins el sector públic és la d’investigador, inclosos els professors universitaris a temps complet (65%).
  11.  Una mica menys de la meitat (45%) treballen en empreses, destacant les indústries farmacèutiques i de productes de laboratori, i una mica menys les agroalimentàries. Les feines predominants d’aquests biotecnòlegs dins les empreses són força diverses, des de caps de seccions de gestió o de planta, fins una majoria de tècnics I+D (35%), especialistes i alguns investigadors.
  12. Dels 139 que treballen en Biotecnologia comptant el sector públic i el privat, els grups majoritaris són els investigadors i professors universitaris (40%), els tècnics (31%) i un 15% que són responsables d’alguna secció de la empresa o institució.

Veient aquests resultats, haig de dir que per a mi ha estat una satisfacció haver realitzat aquest recull i comprovar que globalment són uns resultats molt bons. És un orgull veure com aquelles noies i nois s’han espavilat —que ja ho eren—, i han assolit una bona formació i unes bones feines, ja que en certa manera sóc una mica “el seu pare, el pare biotec”, tal com en broma alguns d’ells m’havien comentat algun cop.

Agraeixo a tots ells l’haver facilitat la informació, i en particular als que n’he demanat i m’han passat alguns detalls que desconeixia d’ells o d’algun dels seus companys, i també gràcies per les fotos que alguns m’han passat.

Per acabar, desitjo que aquesta informació resumida sigui útil tant per a aquests mateixos llicenciats, com també per als actuals i futurs Graduats en Biotecnologia, així com per als professors, gestors i organitzadors de la docència de la Biotecnologia de la URV i d’altres llocs, i també que pugui ser profitosa per als possibles empleadors.

Biotecnologia a la URV

La microbiota fecal desvetlla que els miners de Hallstatt fa 2700 anys tenien una dieta variada, incloent formatge blau i cervesa

1 nov 2021

Click here for the English version: Faecal microbiota from 2700 years

Fa pocs dies vaig llegir aquesta notícia al New Scientist (Wong 2021) que em va atraure de seguida: Minaires –o miners– de l’edat del ferro bevien cervesa i menjaven formatge blau i això s’ha comprovat gràcies als seus excrements fecals. Bé, em va atraure, com podeu suposar no tant per motius escatològics fisiològics –he he–, com per això del consum de cervesa i formatge blau a la prehistòria. Vaig trobar la mateixa notícia pels mateixos dies a altres publicacions digitals de divulgació científica mitjançant les xarxes socials, com per exemple a Cell Press (2021).

La notícia sintetitza –molt– un treball recentment publicat al Current Biology per un grup d’investigadors (Maixner et al 2021), sobretot del Tirol italià i d’Àustria, que han fet un estudi molt complet de mostres de femtes prehistòriques –paleofemtes– de les mines de sal de Hallstatt, a Àustria, per tal de conèixer la dieta i nutrició, i també la microbiota intestinal d’aquests miners (Figura 1). 

Figura 1. Esquema de l’estudi realitzat amb paleofemtes de les mines de Hallstatt per Maixner et al. (2021).

En llegir l’article de Maixner, de seguida va augmentar el meu interès perquè toca diverses àrees que fa temps que m’interessen: a) la història i evolució de les diferents poblacions humanes; b) la microbiota intestinal; i c) els aliments fermentats i els diversos microorganismes implicats. 

L’estudi multidisciplinari inclou anàlisis detallades de microscòpia, metagenòmica i proteòmica d’aquestes mostres. En concret les mostres de paleofemtes de 1-2 cm (vegeu l’aspecte a la Figura 2) són de 1300-1100 aC (edat del bronze), de 600-500 aC (edat del ferro) i de 1720-1780 dC, o sigui del segle 18. Les datacions han estat fetes amb radiocarboni 14C.

Figura 2. Imatge d’una paleofemta humana del 600 aC de les mines de sal de Hallstatt on es veuen grans de fesols, mill i ordi. Tret de Cell Press (2021): Anwora/NHMW.

Perquè les mines de sal de Hallstatt ?

Hallstatt és un bonic petit poble a les vores d’un llac alpí a l’alta Àustria, a uns 80 km de Salzburg, a la regió de Salzkammergut (Figura 3). Com veiem, els topònims fan referència a la sal, per la importància històrica d’aquesta en l’economia de la regió. El poble és conegut sobretot per l’anomenada “cultura de Hallstatt”, el període final de l’edat del bronze (1200-800 aC) i inicial de l’edat del ferro (800-500 aC.), que es desenvolupà sobretot al centre d’Europa, a les conques altes del Rin i el Danubi. 

La cultura de Hallstatt es caracteritza per l’ús avançat del treball amb metalls, ferro sobretot, i l’agricultura. Eren pobles indoeuropeus, societats tribals avançades, precursors dels celtes, i amb molt de comerç amb els pobles mediterranis. A Hallstatt hi han les mines de sal, explotades des del 1400 aC, i hi ha nombrosos enterraments d’aquesta cultura, amb molts objectes d’ús quotidià i ornamentals. L’àrea de Hallstatt-Dachstein fou declarada patrimoni cultural per la UNESCO.

Figura 3. El poble de Hallstatt, a l’alta Àustria (imatge de viajandonuestravida.com)

Les mines subterrànies de sal de Hallstatt són de les més antigues conegudes (Figura 4), amb un registre continu d’explotació, i ofereixen unes condicions ideals de preservació. Vegeu el lloc web de la visita al museu de les mines a https://www.salzwelten.at/en/hallstatt. L’elevada concentració de sal i la temperatura constant de 8ºC a l’interior de les galeries aïllades preserven molt bé els materials orgànics relacionats amb els humans. 

Des del segle 19 els arqueòlegs han estat treballant a Hallstatt, i a més de 2000 tombes protohistòriques a l’entorn del poble, a les mines s’han excavat capes denses de diversos metres de residus, descobrint milers d’eines de fusta i elements de construcció, instruments fets amb pell, centenars de fragments tèxtils de llana, herba, cordes i excrements humans, com els de les mostres d’aquest estudi.

Figura 4. Simulació del treball a les mines de sal de Hallstatt. Tret de https://www.salzwelten.at/en/hallstatt.

La microbiota fecal dels miners

Per estudiar la microbiota fecal, les mostres de paleofemtes han estat tractades per Maixner et al (2021) per extreure el DNA i generar-ne biblioteques gèniques per seqüenciació multiplex amb una plataforma Illumina. Els quasi 300 milions de lectures obtingudes de seqüències de DNA han estat analitzades i comparades amb les bases de dades del NCBI per tal de conèixer la taxonomia de les espècies microbianes i d’altres.

Considerant l’edat de les mostres, el DNA danyat ha estat excepcionalment baix. Aquesta preservació tan bona probablement és deguda a la ràpida dessecació de les mostres a les mines de sal, que redueix molt el dany hidrolític de les biomolècules. La majoria del DNA identificat correspon a bacteris, un 79 a 94%, essent Firmicutes i Bacteroidetes els fílums més abundants.

De les 15 espècies més abundants identificades a les mostres (Figura 5), n’hi ha 13 que són freqüentment associades a la microbiota intestinal humana. Una de les dues “alienes” és Halococcus morrhuae, un arqueu halòfil, que normalment viu en altes concentracions de sal, i que probablement s’incorporà a partir dels cristalls de sal que envoltaven la mostra. L’altra no usual als humans sans és Clostridium perfringens, conegut patogen alimentari que causa fortes diarrees. Però com que aquest fet no s’ha detectat a les mostres, és probable que fos un contaminant, segons els autors. Com veiem a la mateixa Figura 5, les espècies identificades han estat comparades en quant a la seva prevalença en mostres actuals de poblacions no-occidentalitzades i occidentalitzades, entenent per “no-occ…” les d’estil de vida no urbanitzat, dieta amb menjar poc processat i molta fruita i verdura, higiene senzilla, i accés limitat a l’assistència sanitària i productes farmacèutics.

Figura 5. Les 15 espècies més abundants identificades a les mostres de paleofemtes en base a l’análisi metagenòmica del DNA, i comparació de la seva prevalença en mostres contemporànies de poblacions no-occidentalitzades (blau, 725 mostres) i occidentalitzades (marron, 8243 mostres). A la dreta en vermell els fílums i subfílums corresponents. Els triangles blaus són les espècies que són el doble de presents en poblacions no-occidentalitzades. Adaptat de Maixner et al (2021).

Entre les 13 espècies trobades com a més abundants, n’hi ha 8 Firmicutes (5 clostridials, 2 Erysipelotrichia i 1 lactobacil), 1 bacteroidal (Prevotella), 3 Actinobacteria incloent-hi 2 bifidobacteris), i 1 metanogen. Cal destacar que 5 d’aquestes més abundants són de les predominants a la microbiota de poblacions actuals no-occidentalitzades, senyalades amb triangle blau a la Figura 5. El cas més rellevant és Prevotella, el bacteroidal ben conegut en poblacions no occidentalitzades amb dietes més riques en carbohidrats i menys en proteïnes i greixos animals (vegeu el meu post sobre Bacteroides), que en les mostres de paleofemtes és al voltant del 7%. Prevotella copri en particular s’associa amb la digestió de carbohidrats complexes, components majoritaris d’una dieta vegetal rica en fibra i no processada. També és rellevant la presència de 2 bifidobacteris i un lactobacil, bacteris sovint relacionats amb productes làctics i probiòtics. 

No hi ha gaire diferències entre les microbiotes de les mostres de l’edat de ferro, les del segle 18 i les de poblacions actuals no occidentalitzades. Això concorda amb què la dieta majoritària en tots aquests casos és d’aliments no processats, sobretot cereals, i fruites i verdures fresques. En efecte, en l’anàlisi microscòpica de les paleofemtes s’observen restes d’ordi, blat, mill, llegums i diversos fruits silvestres. La principal diferència en la mostra del segle 18 és que el material vegetal és molt més fi, com si hagués estat més triturat. Això suggereix que els miners protohistòrics devien menjar els cereals i llegums en una espècie de puré mentre que els del segle 18 ho devien fer en forma de pa o galetes.

En analitzar DNA animal, com era d’esperar, en el cas de l’humà, eren tots homes, mascles, els miners és clar. Respecte a altres animals que serien part de la dieta, se n’ha trobat de boví i porcí, en totes les mostres.

I menjaven formatge blau i bevien cervesa ?

Sembla que sí. Bé, de fet no ens hauria d’estranyar. Els humans coneixen i elaboren aliments fermentats (vegeu el meu post del 5 març 2021) sobre el concepte d’aliments fermentats) des de fa alguns milers d’anys. En quant als formatges i llets fermentades, és molt probable que amb la revolució neolítica agrícola en diferents llocs fa més 10000 anys (vegeu el meu post del 26 desembre 2012) ja s’aprofités la llet de diversos animals domesticats i s’elaboressin aquests productes fermentats, més duradors que la llet i més digeribles que aquesta. En quant a la cervesa, està ben registrat que els antics egipcis i mesopotamis ja n’elaboraven, en principi com a subproducte dels cereals, fa uns 6000 anys.

El treball de Maixner et al (2021) amb les paleofemtes té el mèrit de demostrar aquest consum a partir de la microbiota fecal, per part d’aquests miners de Hallstatt. En l’anàlisi metagenòmica del DNA present a les mostres han estudiat també els fongs, i han trobat sobretot en una de les mostres de l’edat del ferro (del 600 aC, fa 2600 anys) una gran abundància (fins a un 20% del DNA eucariòtic) de Penicillium roqueforti i de Saccharomyces cerevisiae, així com proteïnes d’aquests fongs a l’estudi proteòmic. Els autors han confirmat que aquests fongs són d’origen antic perquè els nivells de DNA danyat són semblants als del DNA humà endogen de les mateixes mostres. Com que P. roqueforti s’utilitza per a la fermentació de formatges i S. cerevisiae és el llevat present a l’elaboració de cervesa i vi, es pot suposar que aquests identificats haurien estat implicats en el processat d’aquests aliments d’aquella època. Per confirmar-ho, els autors han recorregut a reconstruir els genomes i fer filogènia comparativa amb soques actuals de diferents procedències.

Amb això, han vist que aquests P. roqueforti de les paleofemtes de l’edat del ferro s’assemblen genèticament a les soques de formatges blaus però no a les de Roquefort en concret. Per tant, aquests miners devien elaborar formatges blaus no-Roquefort. Malgrat la semblança, les soques modernes presenten molts fragments de soques d’altres formatges, resultat de transferència genètica horitzontal (TGH), relacionada amb la selecció i encreuaments a què han estat sotmesos, mentre que les de l’edat de ferro no presenten signes de TGH. 

El suggeriment de què aquests miners consumien formatges blaus té un bon recolzament pel fet que avui dia s’elaboren amb una aplicació de sal a la superfície, fins a un 7%, la qual cosa era ben factible a l’entorn de mines de sal. El quallat i elaboració del formatge serien fetes en recipients de fusta com els trobats a les mateixes mines (Figura 6). Aquests formatges blaus, a banda d’aportar nous aromes i textures, tenen els avantatges –com la majoria de formatges i llets fermentades– de molt llarga caducitat i baix contingut en lactosa, la qual cosa afavoreix la digestió, sobretot en pobles amb baixa tolerància, com devia ser el cas en aquella època. 

Figura 6. Recipient de fusta trobat a les mines de sal de Hallstatt, que suposadament era utilitzat en l’elaboració de formatges per a l’extracció del xerigot. Tret de Maixner et al (2021).

En el cas de les S. cerevisiae, les de l’edat del ferro han estat comparades amb 157 soques actuals de pa, cerveses, vins, sake, bioalcohols, de laboratori i silvestres. En una primera anàlisi s’ha constatat que les de les paleofemtes s’assemblen més a les de vi i cervesa, i són ben diferents de les silvestres. Per tant, eren soques ja domesticades en l’elaboració de begudes alcohòliques. En una PCA (Figura 7) s’ha vist més similitud amb S. cerevisiae de cerveses actuals, en concret d’un grup de cerveses (beer 2), més properes a les del vi. Les anàlisis d’alguns gens marcadors i la proteòmica també han confirmat que les soques antigues estaven relacionades amb la fermentació alcohòlica, sigui de cerveses o de vins.

Figura 7. Anàlisi de components principals (PCA) dels genomes de soques de Saccharomyces cerevisiae de diferents procedències. 2604 és el genoma de S. cerevisiae de les paleofemtes de l’edat del ferro. Tret de Maixner et al (2021).

La proposta de que fossin S. cerevisiae de cerveses també lliga amb les anàlisis de la dieta, amb abundància de cereals, com en altres cultures i civilitzacions protohistòriques, com els sumeris i egipcis més o menys des del 3000 aC, força abans que aquestes mostres de les mines de sal.

Bé, tot plegat, aquest és un treball molt interessant que per un costat confirma que els humans elaboren aliments fermentats des de fa alguns milers d’anys, i per altre costat, demostra l’efectivitat dels mètodes moleculars més innovadors per identificar microorganismes de la microbiota, en aquest cas per la bona conservació de les mostres gràcies a la sal. Com sabeu, el protagonisme de la sal al llarg de la història li ha conferit un caràcter quasi sagrat i certament carregat de simbolisme.

Bibliografia

Cell Press (2021) “Ancient feces shows people in present-day Austria drank beer and ate blue cheese up to 2,700 years ago” Science Daily, 13 October. www.sciencedaily.com/releases/2021/10/211013114028.htm.

Maixner F, Sarhan MS, Huang KD, …. 15 ….., Zink KD, Reschreiter H, Kowarik K (2021) Hallstatt miners consumed blue cheese and beer during the Iron Age and retained a non-Westernized gut microbiome until the Baroque period. Current Biology 31, 1-14. https://doi.org/10.1016/j.cub.2021.09.031

Wong C (2021) “Ancient faeces show iron age miners ate blue cheese and drank beer”. New Scientist, 13 October. https://www.newscientist.com/article/2293434-ancient-faeces-show-iron-age-miners-ate-blue-cheese-and-drank-beer/

Wolbachia, el bacteri “feminista”, és eficaç contra el dengue i altres virus

15 agost 2021

Click here for the English version: Wolbachia, the feminist bacterium against dengue

QUI ÉS Wolbachia ?

Wolbachia és un gènere de bacteris endosimbionts (intracel·lulars) d’insectes i altres invertebrats que es va descobrir per estar implicat en el fenomen d’incompatibilitat citoplasmàtica, pel qual alguns encreuaments entre insectes infectats amb el bacteri donen distorsions de la ràtio de sexes o provoquen la mort de l’embrió. Encara que no es podien aïllar en medis de cultiu, l’amplificació amb PCR permeté seqüenciar els gens 16S rRNA i identificar-los com membres de l’ordre Rickettsiales dins el fílum alfa-proteobacteris (O’Neill et al. 1992). Tal com comentava en un altre post d’aquest mateix blog sobre els fílums bacterians, tots els bacteris d’aquest ordre, com també Rickettsia –patogen d’humans –, són endosimbionts obligats de cèl·lules eucariotes, i la relació filogenètica suggereix que els mitocondris –també endosimbionts– es van desenvolupar a partir d’aquest grup.

Com veiem (Figura 1, Figura 2), aquests Wolbachia són pleomòrfics, amb forma arrodonida predominant, de mida 0.2 a 4 micròmetres, residents en vacuoles de l’hoste. Són gram-negatius, amb un genoma aproximat de 1 Mb i uns 1000 gens (Taylor et al. 2018). El gènere Wolbachia fou identificat el 1925 per M. Hertig i S.B. Wolbach al mosquit comú Culex pipiens i ja el van descriure com a intracel·lular i que aparentment infectava només les gònades de l’insecte (Hertig & Wolbach 1924).

Figura 1. Micrografia electrònica de bacteris Wolbachia (colorejats en blau) dins una cèl·lula de mosquit (imatge de Scott O’Neill, tret de Wu et al. 2004a)

——————————————————————————————————-

Figura 2. Micrografies electròniques de Wolbachia: A) Al costat d’un mitocondri dins una cèl·lula embrionària de Drosophila (tret de Zhukova et al. 2008); B) Detall d’una cèl·lula de Wolbachia (tret de Wolbadmin 2021). 

Es troben Wolbachia en el 60% de les espècies d’insectes, i també en altres invertebrats, com aràcnids, nematodes, crustacis isòpodes i altres. De fet, és el bacteri paràsit més comú al món animal (LePage & Bordenstein 2013). L’espècie més comuna és W. pipientis, del qual actualment ja es disposa de la seqüència genòmica completa (Wu et al. 2004b). Sempre són endosimbionts, no es troben mai al medi ambient. Les interaccions amb l’hoste sovint són complexes i en algun cas són més mutualistes que paràsits (Taylor et al. 2018). Wolbachia es transmet a la descendència dels insectes sobretot verticalment per les femelles infectades. Algun cop pot ser transmesa horitzontalment, com s’ha vist en les vespes Trichogramma on es poden transmetre per contagi (Schilthuizen & Stouthamer 1997).

Des d’abans dels anys 1980s s’han descrit aquests bacteris com a “factors sexuals feminitzants” citoplasmàtics (Bull 1983) a diversos invertebrats, com insectes i crustacis isòpodes. D’aquests destaquen els treballs amb Armadillidium vulgare, els porquets de Sant Antoni o cochinillas, on Martin et al (1973) ja deien que aquests factors eren microorganismes, i després Rigaud & Juchault (1992) ja insinuaven que devien ser Wolbachia. Els bacteris feien que mascles es convertissin en femelles funcionals, que tenien descendència majoritàriament femenina. Els Wolbachia intracel·lulars alteren la biologia reproductiva de l’hoste animal de diverses maneres, com veurem tot seguit. Per tot això i com veieu al títol, sovint es fa l’acudit que Wolbachia és un bacteri “feminista” (Yong et al. 2016).

Els gens de Wolbachia també poden transmetre´s horitzontalment (TGH), per transducció, gràcies a un bacteriòfag. El fet que pugui haver-hi diverses soques de Wolbachia al mateix hoste permet l’intercanvi de gens entre elles mitjançant el fag (Kent et al. 2011). Aquest seria el primer cas de TGH detectat en un endosimbiont, fins i tot creuant barreres entre espècies, donant lloc a una distribució global en diversos hostes invertebrats. Tot plegat són fenòmens que contribueixen a l’evolució i per tant s’insinua que els Wolbachia són manipuladors de la biologia dels invertebrats (Werren et al 2008).

MÉTODES DE DIFERENCIACIÓ SEXUAL ALS HOSTES CAUSADA PER Wolbachia, INCLOENT LA FEMINITZACIÓ

Aquests bacteris poden infectar molt diversos òrgans, però les infeccions de les gònades són les que tenen més repercussió fenotípica. Als hostes que contenen Wolbachia, els bacteris són presents sempre als òvuls madurs però no a l’esperma. Per tant, només les femelles infectades són les que passen la infecció a la descendència. Wolbachia maximitza la seva propagació alterant significativament la capacitat reproductiva de l’hoste, de 4 maneres possibles:

1- Els mascles infectats moren durant el desenvolupament larvari, amb la qual cosa augmenta la proporció de femelles infectades. S’ha observat en coleòpters i lepidòpters (Hurst et al 1999).

2- Alguns mascles infectats es desenvolupen com femelles, hi ha feminització, com en alguns lepidòpters (Fujii et al 2001).

3- La partenogènesi, o sigui la reproducció de les femelles, infectades en aquest cas, sense mascles. També és una feminització o predomini de les femelles. Cada cop s’estan veien més casos de partenogènesi relacionats amb la presència de Wolbachia, amb la qual cosa fins i tot s’ha suggerit que aquest fenomen sempre seria atribuïble als bacteris (Tortora et al. 2007). 

La partenogènesi dels himenòpters és de les més conegudes. Aquest ordre d’insectes (formigues, abelles, vespes, borinots i els símfits) tenen un sistema de determinació de sexe haplodiploïde. Alguns d’ells produeixen mascles haploides a partir d’ous no fertilitzats (arrenotòquia), una partenogènesi meiòtica. Però, a més en alguns himenòpters socials les reines o els individus obrers produeixen femelles diploides mitjançant telitòquia, una partenogènesi ameiòtica, on l’òvul haploide se segmenta sense fecundar. Òbviament, el control del sexe de la descendència és un factor clau en l’evolució de les estructurals colonials en aquests insectes socials (Pearcy 2004). La partenogènesi no és exclusiva d’himenòpters, ja que en tenen força altres insectes i altres animals (Wrensch & Ebbert 1993).

La partenogènesi causada per Wolbachia a la vespa Trichogramma ha estat força estudiada. El bacteri és al citoplasma dels òvuls de la vespa on indueix la duplicació dels gàmetes, donant lloc a una generació de tot femelles, o sigui és una completa partenogènesi, de tipus telitòquia (Schilthuizen & Stouthamer 1997, Huigens & Stouthamer 2003). 

A més de Wolbachia, aquesta inducció de la partenogènesi també s’ha observat en Cardinium (Jeong & Stouthamer 2004), un altre bacteri gramnegatiu – un bacteroidetes en aquest cas– que parasita altres vespes, del gènere Encarsa (Zchori-Fein et al. 2004). 

4- La incompatibilitat citoplasmàtica (IC CI en anglès)

És la incapacitat dels mascles infectats per Wolbachia de reproduir-se amb femelles no infectades o infectades amb una altra soca del bacteri. A l’esquerra de la Figura 3 veiem que l’esperma no infectat pot fecundar tant òvuls infectats com els no infectats amb Wolbachia, i a la dreta veiem com l’esperma modificat per la infecció amb Wolbachia quan fecunda els òvuls que no contenen el bacteri, s’indueix la IC, i l’embrió mor i no arriba a terme. 

Aquesta IC s’ha relacionat amb deficiències a la primera divisió mitòtica de l’embrió, amb errors a l’obertura de la membrana nuclear paterna, inestabilitat de les histones maternes sobre el DNA patern i replicació alentida d’aquest DNA, a més de defectes als cromosomes paterns (LePage & Bordenstein 2013).

Figura 3. Incompatibilitat citoplasmàtica induïda per Wolbachia. La infecció per Wolbachia (W, porpra) causa una modificació a l’esperma que pot ser revertida pels òvuls de femelles infectades, però que porten a la mort de l’embrió si els òvuls no estan infectats. W–, sense Wolbachia; W+, amb Wolbachia; W modified, esperma modificat amb Wolbachia; CI, Incompatibilitat citoplasmàtica (Imatge de R.M. Brucker, treta de LePage & Bordenstein 2013).

Aquesta incompatibilitat unidireccional implica un clar augment a la descendència de femelles infectades amb Wolbachia, amb la qual cosa és un mecanisme de selecció positiva del bacteri. Tanmateix, aquest mecanisme de CI no influeix sobre el sexe de l’embrió.

Molts d’aquests efectes de diferenciació sexual, i sobretot la feminització i mort dels mascles poden portar a la formació de noves espècies. Per exemple, s’ha observat la pèrdua d’algun dels cromosomes sexuals, i també que les incompatibilitats degudes a la infecció amb diferents soques de Wolbachia poden afavorir la especiació dels hostes sense haver-hi barreres ecològiques o geogràfiques (Charlat 2003).

AVANTATGES DE LA “INFECCIÓ” AMB Wolbachia PER A L’HOSTE

A banda dels possibles efectes evolutius suara comentats, s’ha comprovat que alguns hostes es beneficien de la presència endosimbiòtica de Wolbachia. Per tant, encara que parlem de “infecció” i “paràsits”, la relació és sobretot mutualística. 

Uns dels avantatges és la resistència viral trobada a Drosophila i a diversos mosquits, que quan són infectats amb Wolbachia són molt més resistents a virus RNA (Hedges et al. 2008), com veurem tot seguit. També s’ha observat que els bacteris ajuden a Drosophila en el metabolisme de ferro i algunes vitamines. En el cas dels nematodes com les filàries, sembla que Wolbachia li proporciona al cuc alguns compostos necessaris per a la seva reproducció (Foster et al. 2005).

Wolbachia PER COMBATRE VIRUS HUMANS

Hi ha força virus patògens d’humans que són transmesos per mosquits. Informalment els virus transmesos per artròpodes s’anomenen arbovirus (de arthropode-borne virus). Dels mosquits, Aedes aegypti és el que té més rellevància per ser el vector transmissor d’una sèrie de malalties víriques tropicals problemàtiques actualment, com el dengue, la febre groga, el zika, el chikungunya, el virus del Nil occidental o la mateixa malària. Moltes d’aquestes malalties d’arbovirus estan molt poc controlades i els virus causants són patògens emergents o reemergents que produeixen malalties importants i epidèmies per tot el món (Conway et al. 2014). Les causes són sobretot l’augment de població i de mobilitat, la urbanització i la pèrdua d’àrees forestals. Per exemple, el nombre de casos simptomàtics de dengue s’ha doblat els darrers 10 anys, la meitat dels humans viuen en àrees endèmiques de dengue i s’estima que cada any hi ha un total de 390 milions de noves infeccions i uns 13000 morts més. Aquest escenari quasi pandèmic ha portat a la OMS designar el dengue com una de les 10 principals amenaces de la salut mundial (Gil Ferreira et al. 2020).

Actualment, la majoria d’estratègies de control dels arbovirus es basen en insecticides i en reduir els ambients on prosperen els mosquits vectors, o bé en tractaments simptomàtics no específics de les malalties ja que en la majoria d’aquests casos encara no hi ha vacunes assequibles. Tanmateix, els insecticides no són específics, causen toxicitat ambiental i indueixen la resistència a aquests compostos. Calen estratègies més efectives i sostenibles urgentment (Gil Ferreira et al. 2020), i aquí és on entra Wolbachia.

Com hem vist, característiques de Wolbachia com la incompatibilitat citoplasmàtica la fan útil per promoure derives genètiques a una població d’insectes. El fet que les femelles infectades amb Wolbachia produeixen descendència tant de mascles infectats com dels no-infectats mentre que les femelles no infectades només puguin tenir descendents amb mascles no infectats dona lloc a un avantatge reproductiu per a les infectades que fa augmentar ràpidament la presència de Wolbachia (Hancock et al. 2011).

Molts mosquits, incloses algunes de les principals espècies transmissores de malalties, porten Wolbachia. Per exemple, l’esmentat mosquit comú Culex pipiens i altres, porten soques d’aquest bacteri. Però en canvi, Aedes aegypti i altres espècies considerades importants en la transmissió de patògens humans gairebé no tenen Wolbachia de forma natural (Moreira et al. 2009).

Per això, s’hi va treballar i es va aconseguir amb èxit, la transfecció de Wolbachia als mosquits Aedes mitjançant tècnica de microinjecció al laboratori, tant en el mosquit tigre Ae. albopictus (Xi et al. 2005), com per a Ae. aegypti (McMeniman et al. 2009). 

L’avenç important va esdevenir tot seguit quan es va descobrir que aquests Wolbachia transferits promovien una interferència amb els virus patògens humans transmesos pels mosquits. En efecte, es va demostrar el bloqueig de replicació dels virus del dengue, Zika, febre groga i virus Mayayo (Moreira et al. 2009). Els mecanismes d’aquest bloqueig sembla que són diversos, com una major producció d’espècies reactives d’oxigen (ROS) i la competència pels recursos cel·lulars –com el colesterol– entre Wolbachia i els virus. A més a més, s’ha observat que el bacteri estimula el sistema immune del mosquit impedint les infeccions víriques, amb la qual cosa el nombre de mosquits transmissors als humans és menor (Moreira et al. 2009, Gil Ferreira et al. 2020).

S’han aplicat diverses estratègies d’introducció dels Aedes infectats amb Wolbachia en poblacions on hi ha els virus, i la que està funcionant millor és alliberar un nombre relativament reduït de mosquits portadors de Wolbachia, tant mascles com femelles, a la natura. El nombre d’aquests mosquits va creixent i van passant els bacteris a la població silvestre de mosquits mitjançant el mecanisme d’incompatibilitat citoplasmàtica, i arriben a ser majoria en pocs mesos (Figura 4).

Figura 4. Esquema de com els mosquits infectats amb Wolbachia alliberats en una població natural poden reemplaçar als mosquits silvestres no infectats (Moronta 2016).

Aquesta estratègia té els avantatges d’utilitzar mètodes naturals, no és gaire costosa, és fàcil de portar a terme, i és sostenible, ja que un cop els mosquits infectats són majoria es mantenen sense intervenció humana. Aquesta estratègia està en línia amb l’Agenda 2030 de Desenvolupament Sostenible de l’ONU (Gil Ferreira et al. 2020).

En l’aplicació d’aquesta estratègia amb Wolbachia i els mosquits cal destacar el World Mosquito Program (2021), que s’inicià el 2004 gràcies a la Fundació Bill & Melinda Gates i a la Fundació del NIH dels USA. El 2011 es van començar les primeres proves de camp a Cairns, al Nord d’Austràlia. S’hi van anar introduint tandes d’ous de mosquits amb la col·laboració dels membres de la comunitat, durant 10 setmanes, aconseguint taxes exitoses de mosquits-Wolbachia de més del 90% (World mosquito Program / Our story). Això va anar aparellat amb una quasi pràctica desaparició de la malaltia del dengue (Figura 5, 1a columna esquerra) i la proporció de mosquits-Wolbachia s’ha mantingut estable durant 8 anys (Gil Ferreira et al. 2020). Posteriorment el WMP s’ha anat estenent a Malàisia (Wolbadmin 2021), Indonèsia (Olazo 2021), Vietnam i altres països amb presència de dengue i s’ha comprovat que l’estratègia funciona molt bé (Figura 5).

Figura 5. Reducció del dengue en 1-2 anys en poblacions d’Austràlia (Cairns, Townsville), Indonèsia (Yogyakarta), Vietnam (Vinh-Luong), Brasil (Rio, Niteroi) i Colòmbia (Bello, Medellín) on s’han alliberat mosquits infectats amb Wolbachia, dins el World Mosquito Program (tret de WMP Impact: dades de desembre 2020)

Aquest està essent un dels exemples més exitosos de com un vector, el mosquit, pot ser utilitzat com un aliat per combatre els arbovirus (Gil Ferreira et al. 2020).

D’altra banda, en el cas dels nematodes que contenen Wolbachia com les filàries, que provoquen les filariosis, malalties tropicals humanes i d’altres animals domèstics, la solució està essent el tractament amb antibiòtics com doxiciclina o altres que inhibeixen el bacteri, amb la qual cosa excepcionalment s’empra un antibiòtic per combatre un paràsit invertebrat (Fundación iO 2021, Taylor et al. 2018).

BIBLIOGRAFIA 

Bull JJ (1983) Evolution of Sex Determining Mechanisms. Benjamin/CummingS Publ. Co., Menlo Park, CA, USA.

Charlat S (2003) Evolutionary consequences of Wolbachia infections. Trends in Genetics 19(4):217–23

Conway MJ, Colpitts TM, Fikrig E (2014) Role of the Vector in Arbovirus Transmission. Annual Review of Virology 1:1,71-88

Foster J, Ganatra M, Kamal I, et al. (2005) The Wolbachia Genome of Brugia malayi: Endosymbiont Evolution within a Human Pathogenic Nematode. PLOS Biology 3(4): e121.

Fundación iO (2021, August 12) Enfermedades: WolbachiaFundación iO. Retrieved from https://fundacionio.com/salud-io/enfermedades/wolbachia/

Fujii Y, Kageyama D, Hoshizaki S, Ishikawa H, Sasaki T (2001) Transfection of Wolbachia in Lepidoptera: the feminizer of the adzuki bean borer Ostrinia scapulalis causes male killing in the Mediterranean flour moth Ephestia kuehniella. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences 268(1469): 855–859.

Gil Ferreira A, Fairlie S, Luciano Moreira LA (2020) Insect vectors endosymbionts as solutions against diseases. Curr Opinion in Insect Sci 40, 56-61. 

Hancock PA, Sinkins SP, Godfray HC (2011) Strategies for introducing Wolbachia to reduce transmission of mosquito-borne diseases. PLOS Negl. Trop. Dis. 5(4): e1024.

Hedges L, Brownlie J, O’Neill S, Johnson, K (2008) Wolbachia and Virus Protection in Insects. Science 322(5902):702

Hertig M, Wolbach SB (1924) Studies on Rickettsia-Like Micro-Organisms in Insects. Journal of Medical Research44(3):329-374.

Huigens ME, Stouthamer R (2003). Parthenogenesis associated with Wolbachia. In: Bourtzis K, Miller TA (eds) Insect Symbiosis. CRC Press: Boca Raton, FL, pp 247–266.

Hurst G, Jiggins FM, Graf von der Schulenburg JH, Bertrand D et al. (1999) Male killing Wolbachia in two species of insects. Proceedings of the Royal Society B 266 (1420): 735-740.

Jeong G, Stouthamer R (2004) Genetics of female functional virginity in the Parthenogenesis-Wolbachia infected parasitoid wasp Telenomus nawai (Hymenoptera: Scelionidae). Heredity 94 (4): 402–407. 

Kent BN, Salichos L, Gibbons JG, et al. (2011) Complete Bacteriophage Transfer in a Bacterial Endosymbiont (Wolbachia) Determined by Targeted Genome Capture. Genome Biology and Evolution 3:209–218

LePage D, Bordenstein SR (2013) Wolbachia: can we save lives with a great pandemic ? Trends in Parasitology 29, 385-393. 

Martin G, Juchault P, Legrand JJ (1973) Mise en evidence d’un micro-organisme intracytoplasmique symbiote de l’oniscoïde Armadillidium vulgare Latr. dont la presence accompagne l’intersexualite ou la feminisation totale des males genetiques de la lignee thelygene. C.R. Acad. Sci. Paris, 276,2312—2316.

McMeniman CJ, Lane RV, Cass BN et al. (2009) Stable introduction of a life-shortening Wolbachia infection into the mosquito Aedes aegyptiScience 323:141-144

Moreira LA, Iturbe-Ormaetxe I, Jeffery Ja, Lu G, Pyke AT, Hedges LM, Rocha BC, Hall-Mendelin S, Day A, Riegler M et al. (2009) A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, chikungunya, and plasmodium. Cell139:1268- 1278. 

Moronta F (2021 August 12) La bacteria Wolbachia puede frenar la expansión del Zika. Félix-Moronta-Blog, 06/05/2016. Retrieved from http://felixmoronta.pro/wolbachia-zika/

Olazo A (2021, June 15)Wolbachia, la bacteria que infecta mosquitos y reduce la transmisión del dengue en un 77%. Robotitus. Retrieved from https://www.robotitus.com/wolbachia-la-bacteria-que-infecta-mosquitos-y-reduce-la-transmision-del-dengue-en-un-77

O’Neill SL, Giordano R, Colbert AME, Karr TL, Robertson HM (1992) 16S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility. Proc Natl Acad Sci USA 89, 2699-2702. 

Pearcy, M. (2004). Conditional Use of Sex and Parthenogenesis for Worker and Queen Production in Ants. Science 306(5702): 1780–1783.

Rigaud T, Juchault P (1992) Genetic control of the vertical transmission of a cytoplasmic sex factor in Armadillidium vulgare Latr. (Crustacea, Oniscidea). Heredity 68, 47-52

Schilthuizen MO, Stouthamer R (1997) Horizontal transmission of parthenogenesis-inducing microbes in Trichogramma wasps. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 264, 361-366. 

Taylor MJ, Bordenstein SR, Slatko B (2018) Microbe Profile: Wolbachia: a sex selector, a viral protector and a target to treat filarial nematodes. Microbiology 164(11):1345–1347

Tortora GJ, Funke BR, Case CL (2007) Microbiology: an introduction. Pearson Benjamin Cummings.

Werren JH, Baldo L, Clark ME (2008) Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. Nature Reviews Microbiology 6, 741-751. 

Wikipedia (2021 August 12). WolbachiaWikimedia Foundation. Retrieved from https://en.wikipedia.org/wiki/Wolbachia

Wolbadmin (2021 August 12). What is WolbachiaWolbachia Malaysia. Retrieved from https://www.imr.gov.my/wolbachia/2021/05/25/what-is-wolbachia/

World Mosquito Programm (2021 August 12). The World Mosquito Program’s Wolbachia Method. World Mosquito Program. Retrieved from https://www.worldmosquitoprogram.org

Wrensch DL, Ebbert MA (1993) Evolution and Diversity of Sex Ratio in Insects and Mites. Chapman & Hall: New York and London.

Wu M et al. (2004a) Genome Sequence of the Intracellular Bacterium WolbachiaPLoS Biology 2(3): e76.

Wu M, Sun LV, Vamathevan J, Riegler M, Deboy R et al. (2004b) Phylogenomics of the Reproductive Parasite Wolbachia pipientis wMel: A Streamlined Genome Overrun by Mobile Genetic Elements. PLoS Biology 2(3): e69.

Xi Z, Dean JL, Khoo C, Dobson SL (2005) Generation of a novel Wolbachia infection in Aedes albopictus (Asian tiger mosquito) via embryonic microinjection. Insect Biochem Mol Biol 35:903-910

Yong E (2016) I Contain Multitudes: The microbes within us a grander view of life. Ed. Penguin Random House, New York USA

Zchori-Fein E, Perlman SJ, Kelly SE, Katzir N, Hunter MS (2004). Characterization of a ‘Bacteroidetes’ symbiont inEncarsia wasps (Hymenoptera: Aphelinidae): proposal of ‘Candidatus Cardinium hertigii’. Int J Syst Evol Microbiol 54: 961–968.

Zhukova M, Voronin D, Kiseleva EV (2008) High temperature initiates changes in Wolbachia ultrastructure in ovaries and early embryos of Drosophila melanogasterCell and Tissue Biology 2:546-556.

Aliments fermentats: consens recent sobre aquest concepte

5 març 2021

Click here for the English version: Fermented foods: consensus statement and reviewing them

El terme “aliments fermentats” ha estat molt utilitzat però fins ara no ha tingut una definició clara, hi ha incoherències relacionades amb l’ús del terme “fermentat” i a vegades s’utilitza incloent productes més o menys relacionats, com els probiòtics. Tot i que aquests aliments s’han consumit durant milers d’anys, darrerament reben una atenció creixent entre biòlegs, nutricionistes, altres científics i consumidors. 

Per tal de desenvolupar-ne una definició i descriure el paper dels aliments fermentats en la dieta humana, l’Associació Científica Internacional de Probiòtics i Prebiòtics (ISAPPva convocar el setembre de 2019 a un grup d’experts per fer-ho de forma consensuada. La ISAPP és una organització sense ànim de lucre, dirigida per científics i acadèmics, i encara que és finançada per empreses, les seves activitats no estan estipulades per la indústria. La seva missió és proporcionar informació objectiva i científica sobre probiòtics, prebiòtics i altres temes relacionats amb la nutrició i la salut.

Figura 1. Portal d’internet de l’Associació Científica Internacional de Probiòtics i Prebiòtics (ISAPP)

Aquests experts del ISAPP han estat un total de 13, procedents dels USA, Irlanda, Canadà, Bèlgica i Corea S., la majoria de centres universitaris i alguns d’empreses, i les seves conclusions han estat publicades recentment (Marco et al 2021).

Una de les principals conclusions del consens al que han arribat és la mateixa definició: aliments i begudes fermentats són els elaborats mitjançant el creixement microbià desitjatel qual comporta conversions enzimàtiques dels components dels aliments. En aquest treball, a banda de repassar quins són, també defineixen la distinció entre aliments fermentats i probiòtics, tracten el coneixement actual sobre seguretat, riscos i beneficis d’aquests aliments, i finalment en revisen la regulació i la possibilitat d’incloure’ls a les directrius dietètiques dels diferents països.

Què són els aliments fermentats ?

Els humans van aprendre fa alguns milers d’anys a consumir i elaborar aliments fermentats, probablement en paral·lel al desenvolupament de l’agricultura i la ramaderia. Vegeu per exemple el meu article sobre formatges i llets fermentades fets fa 7000 anys.

El consum d’aliments fermentats es va estendre i promoure des dels inicis a totes les civilitzacions sobretot perquè és una de les maneres més efectives de conservar aliments, degut a la formació de compostos que inhibeixen altres microbis perjudicials i/o patògens. Entre aquests compostos produïts pels microorganismes que fan la fermentació destaquen els àcids orgànics (com el làctic o l’acètic), l’etanol o les bacteriocines. Només cal recordar per un costat tots els productes lactis derivats de la llet que es conserven més temps que la llet gràcies a l’àcid làctic produït pels bacteris dels formatges, iogurts, etc. I per un altre costat, el consum de cerveses o vins com una bona alternativa més higiènica en llocs i èpoques on no es disposava d’aigua corrent no contaminada. La major perdurabilitat dels aliments fermentats encara té molta importància avui dia en regions pobres del món on no hi ha prou seguretat alimentària o on no hi ha gaire accés a l’electricitat, la refrigeració o l’aigua neta.

Altres mètodes de conservar aliments són la disminució de l’activitat aquosa (aw) mitjançant l’addició de sal o sucre o l’assecat, l’addició de compostos inhibidors (per ex. espècies o el fumat), fer el buit, i els tractaments tèrmics (fred o calor), entre altres.

L’altre motiu del consum d’aliments fermentats és l’aparició de noves qualitats organolèptiques, de gustos, olors o textures agradables i diferents, degut a les transformacions bioquímiques dels microorganismes en la composició de l’aliment. 

Els aliments fermentats són una part important de la dieta humana, fins i tot en regions desenvolupades on la seguretat alimentària i la conservació dels aliments estan ben controlades. S’ha estimat que actualment es produeixen i consumeixen globalment més de 5000 varietats d’aliments (i begudes) fermentats (Tamang et al 2016).

Així doncs, en l’esmentada definició de consens de l’ISAPP queda ben clar que els aliments fermentats són aquells elaborats de forma volguda pels humans on cal l’activitat dels microorganismes i on aquests duen a terme una sèrie de reaccions enzimàtiques dels components de l’aliment.

Encara que els enzims endògens o exògens, procedents de plantes, animals o altres fonts, també poden estar presents en aquests aliments, aquesta activitat no és suficient per ser considerat com aliment fermentat, ja que cal l’activitat microbiana.

D’altra banda, la principal diferència amb els aliments deteriorats per microorganismes és que aquests aliments ho són de manera no volguda i els fermentats ho són deliberadament i controladament per generar-ne qualitats desitjables.

També cal puntualitzar que als aliments fermentats l’acció dels microorganismes no sempre és mitjançant el metabolisme de fermentació. Efectivament, des del punt de vista bioquímic, “fermentació” és un tipus de metabolisme on la font d’energia i tant el donador com l’acceptor d’electrons són compostos orgànics (sobretot carbohidrats), on els ATP es sintetitzen per fosforilació de substrat (per exemple a la glucòlisi) i no hi ha formació d’ATP per fosforilació oxidativa amb cadenes de transport d’electrons lligada a membranes, com seria el cas de la respiració (Figura 2). Molts aliments fermentats clàssics ho són per metabolisme fermentatiu com la fermentació làctica o l’alcohòlica, però també es consideren aliments fermentats alguns on els microorganismes estan fent respiració aeròbica, com els bacteris acètics del vinagre o les floridures d’alguns formatges. Per tant el terme “aliments fermentats” té una visió més ampla, independent del metabolisme, on només cal la intervenció activa i volguda de microorganismes.

Figura 2. Reaccions principals dels mecanismes bàsics de síntesi d’ATP: Fosforilació oxidativa per cadenes transportadores d’electrons (dalt) i Fosforilació a nivell de substrat (baix).

Quins són els aliments fermentats i els microorganismes implicats ?

En trobem una bona relació a nivell mundial al treball de Tamang et al (2016), amb els microorganismes que hi intervenen, resumits a la Taula 1. Naturalment aquest article no és una relació exhaustiva, ja que per exemple hi trobem a faltar la sobrassada balear, si bé apareix la “soppressata” siciliana, probablement relacionada en origen. Veiem alguns dels aliments fermentats més coneguts a la Figura 3.

Taula 1. Tipus d’aliments fermentats i els microorganismes implicats (resumit de Tamang et al (2016)

TipusProductesPaïsosMicroorganismes
Llets fermentades i derivatsIogurts, formatges, sèrum de mantega (buttermilk), quefir, kumisleben, etc. Són de vaca i també de molts altres mamífers, com ovella, cabra, euga, camella, iac i búfalaTot el mónBacteris làctics
Alguns bifidobacteris
Alguns llevats
Floridures (Penicillium)
Productes vegetals (fruits, talls, bulbs, fulles, arrels, llegums) fermentatsOlives, col àcida (sauerkraut), kimchi, molt diversos confitats de raves, albergínies, cebetes, pastanagues, fermentats de la mandioca, productes de la soja (salsa de soja, miso, nattotempeh).
Vins (veure a baix)
Tot el mónBacteris làctics
Bacillus i altres firmicutes
Llevats
Algunes floridures (Rhizopus)
Altres fermentats derivats de vegetalsVinagre, té fermentat com la kombutxa, i cacau fermentat per fer xocolataTot el mónBacteris acètics
Llevats
Carns fermentadesEmbotits com xoriço, peperoni, salsitxes, sobrassadaTot el món, sobretot EuropaBacteris làctics
Altres firmicutes
Alguns llevats 
Peix i salses de peix fermentatMolt diversos, ex. nuroc mam, nam pla
Garum
Àsia orientalAntiga RomaBacteris làctics
Altres firmicutes
Altres bacteris
Begudes alcohòliques de cereals produïdes amb cultius amilolítics fúngicsSakeJapóAspergillus oryzae
Llevats
Begudes alcohòliques de cereals produïdes amb saliva humanaTxitxa (chicha)SudamèricaSaliva
Llevats
Bacteris làctics i altres
Begudes alcohòliques de cereals (ordi, blat, etc) amb maltatgeCervesesTot el mónLlevats
Alguns bacteris làctics
Begudes alcohòliques de parts de plantesPulque de l’agaveMèxicBacteris làctics
Zymomonas
Llevats
Begudes alcohòliques de fruitesVins de vinyaTotes les regions de clima temperatLlevats
Oenococcus (ferm. malolàctica)
Begudes alcohòliques de la melhidromel
tej
Sobretot món antic
Etiopia
Llevats
Bacteris làctics

Com veiem a la Taula 1, els principals microorganismes de molts aliments fermentats des de les llets a carns i vegetals i altres, són els bacteris làctics. Són bacteris grampositius del fílum Firmicutes (amb baix G+C al DNA), no formadors d’espores, anaerobis aerotolerants, i considerats com a segurs. Altres bacteris responsables d’alguns aliments fermentats són els Bacillus (Firmicutes esporulats), altres Firmicutes com Staphylococcus, bacteris del fílum Actinobacteris (grampositius amb alt G+C al DNA) com BifidobacteriumPropionibacterium i Brevibacterium. Dins els pocs bacteris gramnegatius que hi trobem, veiem que destaquen els acètics (del fílum Alfaproteobacteris) i també cal esmentar a Zymomonas, del mateix fílum. Podeu veure la ubicació filogenètica de tots aquests bacteris dins el meu post “Bacteris: 21 fílums principals, amb 147 gèneres importants“.

A la mateixa Taula 1 veiem que a banda dels bacteris, sobretot els làctics, els altres microorganismes més importants són els llevats, sobretot Saccharomyces, fongs ascomicets unicel·lulars. Altres fongs agents actius en aliments fermentats són sobretot alguns dels filamentosos, com els també ascomicets Penicillium i Aspergillus, i el zigomicet Rhizopus.

Figura 3. Diversos aliments fermentats: sobrassada, formatges, formatge blau, iogurt, olives, salsa de soja, cervesa i vi.

Microorganismes vius o morts als aliments fermentats ?

Els microorganismes que han intervingut activament en l’elaboració dels aliments fermentats poden estar presents i viables, o sigui vius, en alguns d’aquests i en canvi en altres són absents perquè se’ls ha separat de l’aliment o aquest ha tingut un tractament, normalment tèrmic, que els ha eliminat (Marco et al 2021).

Entre els aliments fermentats que contenen microorganismes vius podem esmentar el iogurt, quefir i altres llets fermentades, la majoria de formatges, miso, natto i tempeh, molts dels productes vegetals fermentats que no se’ls ha tractat tèrmicament com les olives, molts dels embotits, la kombutxa, i algunes cerveses.

Els aliments fermentats on s’han eliminat o apartat els microorganismes són per ex. el pa, els productes vegetals fermentats tractats tèrmicament, la salsa de soja, el vinagre, els vins, la majoria de cerveses, i les faves de cafè i de cacau un cop torrefactes.

En molts aliments fermentats sense inocular, o sigui amb la microbiota espontània pròpia, hi ha més d’un microorganisme responsable dels canvis que es duen a terme des de l’aliment original al fermentat. Sovint hi ha una successió de tipus de microorganismes, en funció de la composició de l’aliment i de les condicions ambientals a les que és sotmès: sal, temperatura, sequedat, etc. Per exemple, a la fermentació de les olives de taula primer predominen llevats i altres bacteris, i finalment s’acaben imposant els bacteris làctics.

Diferències respecte als probiòtics

Encara que a vegades els aliments fermentats són etiquetats o nomenats com “probiòtics” o que “contenen probiòtics”, cal deixar clar que no és el mateix i ni molt menys és així en la majoria dels casos. El terme probiòtic només és correcte utilitzar-lo quan s’ha demostrat algun efecte beneficiós per a la salut del consumidor del producte, i que aquest efecte és degut a un microorganisme viu present i ben caracteritzat. Aquest benefici sobre la salut és més enllà dels beneficis nutritius de la matriu de l’aliment que el conté. Per això, els termes “aliment fermentat” i “probiòtic” no poder ser utilitzats un per l’altre.

En el cas d’aliments fermentats que poden contenir algun microorganisme probiòtic, amb efectes demostrats sobre la salut, només hauria de ser etiquetat amb “conté probiòtics” en el cas que el microorganisme probiòtic estigués ben caracteritzat a nivell de soca i que estigués en quantitats significatives al llarg de la vida útil de l’aliment.

Els aliments fermentats i la seguretat alimentària

Els aliments fermentats augmenten la seguretat de l’aliment per al consumidor, en el sentit que hi és més difícil el creixement d’organismes perjudicials o patògens que respecte als aliments originals abans de fermentar. En efecte, sovint contenen quantitats notables d’àcids orgànics, com àcid làctic produït pels bacteris làctics o l’acètic fet pels bacteris homònims. Molts d’aquests productes al mateix temps tenen baixa activitat d’aigua, i contenen sal i altres antimicrobians, amb la qual cosa són coneguts com a segurs des de fa molt temps (Adams & Mitchell 2002). De manera semblant, les begudes que continguin >4% etanol o pH < 4.5 també són considerades microbiològicament segures. 

A més, molts bacteris làctics, siguin autòctons o inoculats, produeixen bacteriocines que inhibeixen altres bacteris indesitjables, com Listeria o Clostridium.

Alguns aliments fermentats també incrementen la seguretat en eliminar compostos tòxics o antinutritius dels aliments crus, com és el cas de moltes fermentacions de cereals, llegums i tubercles. Per exemple, la mandioca conté glicòsids cianogènics que són eliminats a la fermentació per Lactobacillus plantarum (Lei et al 1999). També, a la fermentació de la massa mare (sourdough) alguns bacteris làctics faciliten la degradació mitjançant l’enzim fitasa (una fosfatasa) de l’àcid fític present als cereals, que és un quelant de cations divalents (Ca, Mg, Fe, Zn) i per tant disminueix la seva adsorció (López et al 2001).

A més, es pot afirmar que, amb molt poques excepcions, els microorganismes protagonistes dels aliments fermentats, bàsicament bacteris làctics, llevats i fongs filamentosos, no són patògens ni produeixen compostos tòxics o perjudicials. De fet, molts d’ells, com els mateixos bacteris làctics, però també força altres (com alguns Bacillus, Figura 4) són considerats GRAS per la FDA dels USA (generalment reconeguts com a segurs, en anglès) o QPS per la EFSA europea (presumpció qualificada de seguretat, en anglès). 

Figura 4. Un dels últims ingredients declarats GRAS per la FDA dels USA és justament un Bacillus subtilis que també pot ser utilitzat en aliments fermentats. Tret de US FDA Gras Notices.

Tanmateix, cal sempre tenir molta cura, com en qualsevol tipus d’aliment, cal assegurar-se que els ingredients són frescos i segurs, evitar-ne qualsevol alteració, i tenir uns bons controls al llarg del procés d’elaboració i en el producte acabat, comprovant que no hi hagi cap contaminació dels habituals patògens alimentaris.

Alguns aliments fermentats contenen compostos que poden comportar riscos de seguretat alimentària si son consumits en excés. Aquest és el cas de les begudes alcohòliques, que cal prendre amb molta moderació pels efectes de l’etanol, i cal evitar el seu consum en persones de risc. Per un motiu diferent i no relacionat amb els microorganismes, també cal no consumir en excés els aliments fermentats que contenen sal, com la salsa de soja o el kimchi.

Uns dels pocs compostos produïts pels bacteris làctics que cal controlar són les amines biògenes, que es poden trobar en petites quantitats en aliments fermentats com formatges, embotits, alguns vegetals i el vi, i que poden produir diversos problemes de salut i sobretot migranyes. Cal minimitzar-ne la seva producció controlant els possibles productors i inoculant soques no productores.

Les micotoxines com aflatoxines, ocratoxines i moltes altres, són la principal preocupació dels aliments fermentats amb fongs filamentosos com Aspergillus i Penicillium dels fermentats de soja, formatges i altres (Sivamaruthi et al 2019). Tanmateix, en la majoria d’aquests productes s’utilitzen soques seleccionades, bé per domesticació al llarg de segles o bé més recentment per selecció artificial, que no produeixen toxines.

Beneficis del consum d’aliments fermentats sobre la salut nutritiva humana

Més enllà dels motius de preservació d’aliments i les qualitats organolèptiques, hi ha certes evidències epidemiològiques que suggereixen que les dietes riques en aliments fermentats poden reduir el risc de malalties i augmentar la longevitat, la salut i qualitat de vida. Però aquestes dietes, com pot ser la dieta mediterrània, inclouen altres aliments a banda dels fermentats, i per tant no és segur que els efectes positius siguin deguts als aliments fermentats. A més, amb l’excepció del iogurt i altres llets fermentades, s’han fet pocs estudis clínics ben dissenyats i controlats sobre els possibles beneficis dels aliments fermentats sobre la salut en quant a malalties concretes (Marco et al 2021).

Tanmateix, els efectes indirectes sobre la salut dels aliments fermentats són ben patents quan es consideren els aspectes nutritius. L’activitat microbiana dona lloc a l’enriquiment i/o eliminació de diversos compostos que afecten i milloren la composició nutritiva del producte final.

En primer lloc, els microorganismes redueixen el contingut de sucres altament calòrics, monosacàrids i disacàrids, presents a les llets, carns i vegetals. Això permet reduir l’índex glucèmic i disminuir la intolerància de l’aliment, com la lactosa dels lactis, els fructans del blat, o la rafinosa i estaquiosa dels llegums. Amb la fermentació s’hidrolitzen polisacàrids, proteïnes i greixos, la qual cosa facilita la digestió, i com s’ha comentat, s’eliminen diversos compostos tòxics o antinutritius com l’àcid fític. 

En el cas dels aliments que contenen polifenols, s’ha comprovat que els lactobacils augmenten la biodisponibilitat de flavonoides, tanins i altres compostos bioactius. És ben coneguda la biosíntesi de vitamines, derivats d’aminoàcids, àcids orgànics com l’esmentat àcid làctic, pèptids i cofactors per part dels microbis que fermenten els aliments (Melini et al 2019).

S’ha vist que molts dels microorganismes vius dels aliments fermentats poden sobreviure el trànsit gàstric i arribar al còlon, ja que per exemple molts bacteris làctics són tolerants al pH àcid i les sals biliars i s’ha comprovat que poden arribar a mantenir-se transitòriament al còlon (Elli et al 2006). Encara que és improbable que aquests microorganismes sobrevisquin gaire temps, s’ha vist que sí que poden ser metabòlicament actius al tracte gastrointestinal, i que aquesta colonització a curt termini seria suficient per produir compostos bioactius, inhibir patògens i influir positivament en el sistema immunitari. Aquests efectes són incrementats si hi ha un consum diari i repetit de l’aliment fermentat.

També s’ha vist que els aliments fermentats, i els microorganismes que contenen, influeixen en la composició de la microbiota intestinal pròpia (Taylor et al 2020). Vegeu també González et al 2019 i Le Roy et al 2020. Un altre factor positiu addicional en el cas d’aliments fermentats vegetals és que força components d’aquests són prebiòtics i per tant afavoreixen la microbiota intestinal.

A més, cal tenir en compte la importància del que mengem, i en aquest cas dels aliments fermentats, en relació al sistema immune, ja que en els humans i altres mamífers el 70% d’aquest sistema es troba al tracte gastrointestinal i els aliments són la principal font de contacte entre els antígens externs i el nostre cos. Això és particularment important en els nadons i la colonització microbiana inicial del digestiu. La ingesta d’aliments fermentats durant els primers anys de la infància s’ha associat amb un risc reduït d’atòpia (predisposició genètica a les al·lèrgies) infantil (Alm et al 1999). Per a qualsevol edat, sembla que els microorganismes dels aliments fermentats i els seus components, com per ex. glucopèptid, proteïnes de superfície, exopolisacàrids, lipoteïcoic, o el D-fenil-làctic dels bacteris làctics (Peters et al 2019), són beneficiosos per al sistema immune, sobretot més demostrat en les llets fermentades (Bourrie et al 2016; Foligne et al 2016).

A la Figura 5 veiem un esquema dels mecanismes bàsics dels possibles beneficis dels aliments fermentats.

Figura 5. Mecanismes bàsics dels beneficis dels aliments fermentats per a la salut, sobretot del punt de vista nutritiu, amb les transformacions dels components dels aliments en substàcies bioactives. SCFA són els àcids grassos de cadena curta. Tret de Marco et al 2021.

Finalment, per acabar només comentar que malgrat que els aliments fermentats són consumits arreu del món i que compten aproximadament per 1/3 de la dieta humana, normalment són absents com a aliments recomanats en les guies de dietes (Marco et al 2021). També és una llàstima que la majoria d’informació que surt als mitjans o a les revistes de divulgació o a les xarxes socials sobre aquest tipus d’aliment és exagerat o erroni, sovint fent-los sinònims dels probiòtics.

Bibliografia

Adams M, Mitchell R (2002) Fermentation and pathogen control: a risk assessment approach. Int. J. Food Microbiol. 79, 75–83

Alm J S, Swartz J, Lilja G, Scheynius A, Pershagen, G (1999) Atopy in children of families with an anthroposophic lifestyle. Lancet 353, 1485–1488

Bourrie B C, Willing B P, Cotter P D (2016) The microbiota and health promoting characteristics of the fermented beverage kefir. Front Microbiol 7, 647

Elli M et al (2006) Survival of yogurt bacteria in the human gut. Appl Environ Microbiol 72, 5113–5117

Foligne B et al (2016) Immunomodulation properties of multi-species fermented milks. Food Microbiol 53, 60–69

González S et al (2019) Fermented dairy foods: impact on intestinal microbiota and health-linked biomarkers. Front Microbiol 10, 1046.

Iraporda C. et al (2015) Lactate and short chain fatty acids produced by microbial fermentation downregulate proinflammatory responses in intestinal epithelial cells and myeloid cells. Immunobiology 220, 1161–1169

ISAPP, The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics: https://isappscience.org

Lei V, Amoa-Awua WK, Brimer L (1999) Degradation of cyanogenic glycosides by Lactobacillus plantarum strains from spontaneous cassava fermentation and other microorganisms. Int. J. Food Microbiol. 53, 169–184

Le Roy C I et al (2020) Red wine consumption associated with increased gut microbiota α-diversity in 3 independent cohorts. Gastroenterology 158, 270–272

López HW et al (2001) Prolonged fermentation of whole wheat sourdough reduces phytate level and increases soluble magnesium. J. Agric. Food Chem. 49, 2657–2662

Marco ML, Sanders ME, Gänzle M et al (2021) The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on fermented foods. Nature Rev Gastroenterol Hepatol. https://www.nature.com/articles/s41575-020-00390-5

Melini F, Melini V, Luziatelli F, Ficca AG, Ruzzi M (2019) Health-promoting components in fermented foods: an up-to-date systematic review. Nutrients 11, 1189

Peters A et al. (2019) Metabolites of lactic acid bacteria present in fermented foods are highly potent agonists of human hydroxycarboxylic acid receptor 3. PLoS Genet. 15, e1008145

Sivamaruthi BS, Kesika P, Chaiyasut C (2019) Toxins in fermented foods: prevalence and preventions – A mini review. Toxins 11, 4

Tamang JP, Watanabe K, Holzapfel WH (2016) Review: Diversity of microorganisms in global fermented foods and beverages. Front Microbiol 7, 377

Tarvainen M, Fabritius M, Yang B (2019) Determination of vitamin K composition of fermented food. Food Chem 275, 515–522

Taylor B C et al (2020) Consumption of fermented foods is associated with systematic differences in the gut microbiome and metabolome. mSystems 5, e00901-19

Bacteris que “mengen” plàstic

27 novembre 2018

Click here for the English version: Plastic-eating bacteria

Oceans de plàstic

Els humans estem destrossant el planeta Terra. A banda del canvi climàtic (que encara hi han ignorants que no s’ho creuen), l’exhauriment dels recursos naturals i l’extinció massiva d’espècies animals i vegetals, un dels efectes més “vistosos” és el cobriment del planeta amb deixalles. Com que el 71% de la superfície és marina, la majoria dels residus que no es degraden acaben al mar, i com sabeu, als oceans ja hi ha grans extensions cobertes de residus surants, sobretot plàstics, anomenades “illes de plàstic” (Figura 1). En el cas de la zona centre nord del Pacífic, on conflueixen diferents corrents marines, la “illa” arriba a fer 1500 km de radi, i amb plàstics fins a 200 m de fondària, i segueix creixent. Podeu llegir-ne més, i sobre les conseqüències ambientals, a l’article Sopa de plàstic del Pacífic de la Wikipedia.

F1 great-pacific-garbage-patch

Figura 1. Petita part de la illa de plàstic del Pacífic nord (Tret de oceanandreserveconservationalliance.com)

 

Els plàstics PET

Encara que hi molts tipus de plàstics, un dels més utilitzats i més abundant a les deixalles i a les “illes de plàstic” és el politereftalat d’etilè (o polietilè terfetalat), conegut com a PETo PETE (Figura 2). És un tipus de polímer termoplàstic, vulgarment plàstic, que pertany als denominats polièsters, i s’obté per síntesi a partir del petroli. És innocu, molt resistent i lleuger i té múltiples aplicacions (Figura 3). Només d’ampolles de PET per a begudes refrescants es calcula que se’n venen al món 1 milió per minut. És un material reciclable (vegeu Pet bottle recycling a Wikipedia) però molt resistent a la biodegradació. A la natura pot durar alguns centenars d’anys.

F2 PET molecular structure

Figura 2. El PET, politereftalat d’etilè.

 

F3 pet uses www.technologystudent.com

Figura 3. Les múltiples aplicacions del PET (Tret de http://www.technologystudent.com).

 

El bacteri Ideonella sakaiensis es “menja” el PET

I. sakaiensis (Figura 4) és un bacteri en forma de bacil, gram-negatiu no esporulat aeròbic heteròtrof, mòbil amb un flagel, i catalasa (+) i oxidasa (+) (Tanasupawat et al 2016). Creix a pHs neutres i és mesòfil, amb òptim a 30-37ºC. Pertany al grup filogenètic dels betaproteobacteris, que inclou entre molts altres als coneguts Neisseria (gonorrea i meningitis) i el nitrificant Nitrosomonas.

F4 Ideonella-sakaiensis falsecolorSEM Yoshida S

Figura 4. Ideonella sakaiensis, imatge al microscopi electrònic de rastreig en fals color (Treta de Yoshida et al 2016).

 

La soca201-F6, la primera de la nova espècie I. sakaiensis, fou aïllada d’un abocador i identificada el 2016 per un grup japonès de l’Institut de Tecnologia de Kyoto que cercaven bacteris que utilitzessin el plàstic com a font de carboni, a partir de mostres de restes d’ampolles de PET (Yoshida et al 2016). Van veure que aquest bacteri s’adhereix a un film de PET de baix grau i el pot degradar, mitjançant dos enzims que van caracteritzar: una PETasa i una MHETasa, que acaben donant com a productes àcid tereftàlic i etilenglicol (Figura 5), que són substàncies ambientals benignes i que el bacteri pot metabolitzar. Una colònia de I. sakaiensis va degradar del tot una ampolla de PET de baix grau en 6 setmanes. Els productes PET d’alt grau requereixen ser escalfats per afeblir-los abans que el bacteri pugui degradar-los. Aquest és el primer bacteri trobat com a degradador de PET, i l’utilitza com a única font de carboni i d’energia. Donat que el PET només existeix des de fa 70 anys, aquest bacteri hauria d’haver evolucionat en aquest breu període fins arribar a poder-lo degradar en poques setmanes, enlloc dels centenars d’anys a la natura (Sampedro 2016).

F5 Yoshida fig 3 right

Figura 5. Ruta metabòlica prevista de la degradació de PET per I. sakaiensis: la PETasa extracel·lular hidrolitza el PET donant monohidroxietil tereftàlic (MHET) i l’àcid tereftàlic (TPA). La MHETasa hidrolitza el MHET a TPA i etilenglicol (EG). El TPA és incorporat mitjançant un transportador de TPA (TPATP) i és catabolitzat a ciclohexadiè i aquest a protocatecuïc (PCA) per la DCDDH. Finalment, l’anell del PCA és tallat per una PCA 3,4 dioxigenasa amb oxigen, com és conegut a la degradació dels compostos fenòlics i altres xenobiòtics. Els n. entre parèntesis són els ORF dels gens corresponents (Tret de Yoshida et al 2016).

 

Només es coneixien prèviament alguns microfongs tropicals (Fusarium solani) degradadors del PET, que també excreten esterases. En aquest cas, aquests Fusarium serien utilitzats per modificar el teixit de polièster, per aconseguir teixits més hidrofílics i més fàcils de treballar (Nimchua et al 2008). Cal recordar l’assemblança estructural dels teixits de PET, roba de fibra sintètica (Figura 3), als de fibra natural com el cotó, ja que aquests contenen cutina, que és un polièster de les parts externes de les plantes. Per tant, els enzims de Fusarium o Ideonella deuen ser relativament semblants als que ja hi eren a la natura molt abans d’inventar-se els plàstics.

 

Recent millora genètica de l’enzim PETasa de Ideonella sakaiensis

Per tal d’entendre millor el funcionament i l’especificitat de la PETasa, recentment un grup d’investigadors nord-americans i britànics han caracteritzat l’estructura de la PETasa (Austin et al 2018), sobretot per cristal·lografia de raigs X d’alta resolució, comparant-la amb una cutinasa homòloga, obtinguda de l’actinobacteri Thermobifida fusca. Les principals diferències entre les dues han estat una major polarització en la superfície de la PETasa (pI 9.6) que en la cutinasa (pI 6.3), i per altra banda, com veiem (Figura 6), una amplada més gran de la fissura del lloc actiu en el cas de la PETasa de I. sakaiensis. Això podria ser per acomodar-hi més fàcilment els polièsters aromàtics com el PET.

F6 austin fig 2 modif

Figura 6. Estructures comparades (esquerra) de la PETasa de I. sakaiensis (dalt) i de la cutinasa de l’actinobacteri Thermobifida fusca (baix), obtingudes per cristal·lografia de raigs X d’alta resolució (0.92 Å). La fissura del lloc actiu està senyalada amb un cercle puntejat vermell. Detalls (dreta) del lloc actiu amb diferents amplades de la fissura a la PETasa de I. sakaiensis (dalt) i de la cutinasa de T. fusca (baix) (Tret de Austin et al 2018).

 

Amb la hipòtesi que l’estructura d’aquest lloc actiu de la PETasa hauria resultat de l’evolució d’una semblant a la cutinasa en un ambient amb PET, Austin et al (2018) van procedir a fer mutacions en el lloc actiu de la PETasa per fer-lo més semblant al de la cutinasa i van obtenir un doble mutant S238F/W159H que teòricament faria més estreta l’entrada del lloc actiu (Figura 6). Però la seva sorpresa va ser majúscula quan van veure que el mutant degradava millor el PET (una millora del 20%), amb una erosió del film de PET (Figura 7 C) encara més gran que la PETasa original (Figura 7 B). Van veure que l’explicació era que els canvis de residus (aminoàcids) del mutant afavorien l’encaix del PET al lloc actiu, malgrat fer-ne la fissura més estreta (Austin et al 2018).

F7 austin fig 3 modif

Figura 7. Imatges de microscòpia electrònica de rastreig d’un retall de PET sense microorganismes (A), amb incubació 96 h de la PETasa de la soca I. sakaiensis 201-F6 (B) i de la PETasa del doble mutant S238F/W159H (C) (Tret de Austin et al 2018).

 

A més, aquests autors han vist que aquesta PETasa degrada també altres polièsters semiaromàtics semblants, com el poletilè-2,5-furandicarboxilat (PEF), i per tant aquest enzim pot ser considerat una poliesterasa aromàtica, però no degrada els alifàtics.

La conclusió del seu treball és que l’enginyeria de proteïnes és factible per millorar el rendiment de la PETasa i que cal seguir aprofundint en el coneixement de les relacions entre estructura i activitat per a la biodegradació dels polièsters sintètics (Austin et al 2018).

 

Altres menja-plàstics ?

La descoberta de I. sakaiensis ha tingut molta importància per la possibilitat d’establir un procés de reciclat ràpid del PET, però no és el primer organisme que s’hagi trobat com a consumidor de plàstics. Per cert, veiem les fórmules dels principals plàstics derivats del petroli a la Figura 8.

F8 Shah 2008 Fig 1

Figura 8. Fórmules dels plàstics derivats del petroli més usuals: polietilè (PE), clorur de polivinil (PVC), polipropilè (PP), poliestirè (PS), politereftalat d’etilè (PET o PETE) i poliuretà (PU) (Tret de Shah et al 2008).

 

Doncs bé, repassant la bibliografia, veiem que s’han descrit força casos de microorganismes degradadors de plàstics (Shah et al 2008), sobretot de polietilè, poliuretà i PVC: diversos PseudomonasRhodococcus i Comamonas entre els bacteris, i alguns Penicillium, Fusarium i Aspergillus entre els fongs.

Entre els degradadors de poliuretà destaquen els fongs (Howard 2002), i sobretot l’endòfit de plantes Pestalotiopsis microspora, que pot consumir poliuretà com a única font de carboni (Russell et al 2011).

D’altra banda, és força coneguda la capacitat dels cucs o larves dels escarabats de la farina, els Tenebrio molitor, per mastegar i degradar l’espuma de poliestirè (Yang et al 2015). Alimentades només amb el PS, aquestes larves el degraden completament en uns temps relativament curts. La degradació del PS, com era d’esperar, la fan els bacteris intestinals de l’animal (Figura 9), com s’ha demostrat en aturar-se la degradació quan s’administra antibiòtic a la larva (Yang et al 2015). Un dels bacteris aïllats que s’ha demostrat degradador del PS és Exiguobacterium, un bacil·lal, però no és l’únic. De fet, en fer estudis de metagenòmica de l’intestí de les larves quan mengen PS, s’ha trobat una gran varietat de bacteris, i que aquests varien en funció del plàstic, ja que també s’ha vist la degradació de polietilè. Alguns dels bacteris amb DNA trobat com a predominant serien els enterobacteris Citrobacter i Kosakonia. Sembla que la microbiota intestinal de Tenebrio es modifica i adapta als diferents plàstics ingerits (Brandon et al 2018).

F9 fig Abs Yang 2015 2

Figura 9. Biodegradació del poliestirè pels bacteris intestinals de Tenebrio, el cuc de la farina (Yang et al 2015).

 

Per acabar, com veiem la biodegradació microbiana de plàstics en principi no biodegradables o recalcitrants no ens hauria d’estranyar, ja que per un costat, hi ha “plàstics” naturals com el polihidroxibutirat o l’àcid polilàctic que són fàcilment degradables (Shah et al 2008), i d’altra banda la capacitat adaptativa dels microorganismes per poder arribar a trencar els enllaços químics més recalcitrants és molt gran. Els microbis evolucionen ràpidament, i adquireixen estratègies millors per poder trencar els plàstics fets pels humans (Patel 2018). Ho hem vist en aquest cas de la degradació del PET, que en menys de 70 anys que fa que existeix, alguns microbis ja han trobat la manera d’aprofitar-lo.

El problema segueix sent que estem generant massa quantitat de residus plàstics en molt poc temps i els microorganismes no han tingut temps encara per poder degradar-los. És evident que haurem d’ajudar als nostres companys microbis, no generant més polímers tan poc degradables, i reciclant-los i degradant-los, entre altres maneres, utilitzant aquests mateixos microbis degradadors.

 

Bibliografia

Austin HP et al (2018) Characterization and engineering of a plastic-degrading aromatic polyesterase. Proc Nat Acad Sci 115, 19, E4350-E4357

Brandon AM et al (2018) Biodegradation of Polyethylene and Plastic Mixtures in Mealworms (Larvae of Tenebrio molitor) and Effects on the Gut Microbiome.Environ Sci Technol 52, 6526-6533

Griggs MB (2017 april 24) These caterpillars chow down on plastic bags. Popular Science. http://www.popsci.com

Howard GT (2002) Biodegradation of polyurethane: a review. Int Biodeterior Biodegrad 42, 213-220

https://en.wikipedia.org/wiki/Great_Pacific_garbage_patch

https://en.wikipedia.org/wiki/PET_bottle_recycling

https://en.wikipedia.org/wiki/Polyethylene_terephthalate

Patel NV (2018 april 17) Scientists stumbled upon a plastic-eating bacterium – then accidentally made it stronger. Popular Science. http://www.popsci.com

Russell JR et al (2011) Biodegradation of polyester polyurethane by endophytic fungi. Appl Environ Microbiol 77, 17, 6076-6084

Sampedro J (2016 marzo 10) Descubierta una bacteria capaz de comerse un plástico muy común. El País

Shah AA et al (2008) Biological degradation of plastics: a comprehensive review. Biotechnol Adv 26, 246-265

Tanasupawat et al (2016) Ideonella sakaiensis sp. nov., isolated from a microbial consortium that degrades poly(ethylene terephtalate). Int J Syst Evol Microbiol 66, 2813-2818

Yang et al (2015) Biodegradation and mineralization of polystyrene by plastic-eating mealworms: Part 2. Role of gut microorganisms. Environ Sci Technol 49, 12087-12093

Yoshida et al (2016) A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate). Science 351,1196–1199

 

 

 

Els bacteris làctics de les cerveses: els dolents i els bons

18 agost 2018

Click here for the English version: The good and the bad lactic acid bacteria of beers

No és fàcil “viure” a la cervesa

En principi, la majoria de bacteris làctics (BL), i molts altres bacteris i en general molts microorganismes, no ho tenen fàcil per sobreviure dins la cervesa, ni a d’altres begudes alcohòliques com el vi. Com és conegut, això és un dels motius principals pel qual vins i cerveses hagin estat des de l’antigor una de les maneres més segures higiènicament de beure una cosa semblant a l’aigua i que no estigués contaminada, a banda de les aigües bullides, com el té i altres infusions d’herbes.

Els motius de la difícil supervivència dels microorganismes a la cervesa són l’etanol, el pH força àcid (al voltant de 4), l’escassesa de nutrients degut a què els llevats els han assimilat quasi tots, el poc oxigen dissolt, l’alta concentració de carbònic (un 0.5% en pes/volum) i la presència dels compostos derivats de la humulona (Figura 1) del llúpol: els iso-alfa-àcids, fins a 50 ppm, que són microbicides. Tots aquests obstacles fan molt difícil que qualsevol microorganisme hi pugui prosperar. Les cerveses més susceptibles de creixement microbià no desitjat són les que algun dels obstacles o impediments esmentats està esmorteït: cerveses amb pH més alt de 4.5, o amb poc etanol o poc CO2, o amb sucres afegits -que són nutrients-, o amb poca quantitat dels compostos derivats del llúpol (Vriesekoop et al 2012).

 

Fig 1 512px-S-Humulone_Isomerization.svg

Figura 1. La humulona (esquerra) del llúpol es degrada durant l’elaboració de la cervesa a isohumulona (dreta) i altres iso-alfa-àcids, compostos amargs característics i microbicides (Wikipedia; Sakamoto & Konings 2003)

 

El pH àcid de la cervesa (lleugerament superior al vi) inhibeix molts dels bacteris patògens més coneguts (Figura 2). I els casos que veiem que podrien créixer a aquest pH a prop de 4, són inhibits pels altres factors com l’etanol.

Fig 2 Menz 2009 jib49-fig-0002-m

Figura 2. Marges de pH àcid per al creixement de diversos bacteris, comparat amb el pH típic de les cerveses. Tret de Menz et al (2009).

 

Els bacteris làctics dolents a la cervesa

Malgrat el que acabem de veure, alguns bacteris -concretament alguns dels làctics- han estat capaços d’adaptar-se evolutivament a les condicions estrictes de les cerveses, i hi poden sobreviure i espatllar-les. En concret, les espècies més freqüents com perjudicials per a la qualitat de les cerveses són Lactobacillus brevis i Pediococcus damnosus (Figura 3). La primera és la més freqüent, i pot donar gustos i aromes no desitjats, així com terbolesa al producte final. P. damnosus té l’avantatge de créixer a baixes temperatures, i pot produir també aromes no volguts, destacant-ne el diacetil (Vriesekoop et al 2012). Alguns Pediococcus i Lactobacillus poden adherir-se als llevats, induint que sedimentin, la qual cosa retarda la fermentació (Suzuki 2011).

 

Fig 3 brevis i pedio

Figura 3. Lactobacillus brevis (esquerra) i Pediococcus damnosus (dreta) al microscopi electrònic de rastreig.

 

Alguns Pediococcus també poden ser els responsables de l’aparició d’amines biògenes en algunes cerveses, amb risc per al consumidor. Les amines en certa concentració són tòxiques, poden ser presents en alguns aliments fermentats com formatges, embotits i begudes alcohòliques com vins i cerveses, i es produeixen per descarboxilació d’aminoàcids per part dels BL. El nivell de tiramina i altres amines ha estat utilitzat com a mesura de la qualitat en algunes de les cerveses belgues elaborades amb BL (Loret et al 2005).

A banda d’aquests BL, altres bacteris relacionats amb problemes de contaminació a les cerveses són els acètics com Acetobacter, típicament associats amb l’entrada d’oxigen  a l’envasat o a la distribució. Altres bacteris perjudicials són alguns enterobacteris, com Shimwellia pseudoproteus o Citrobacter freundii, que proliferen a les primeres etapes de fermentació, i produeixen butanodiol, acetaldehid i altres compostos aromàtics no desitjats (Vriesekoop et al 2012). Uns altres bacteris perjudicials per a la cervesa, sobretot un cop embotellada, són Pectinatus i Megasphaera, que són anaerobis estrictes, de la família dels clostridis, i poden produir sulfur d’hidrogen i àcids grassos de cadena curta, tots ells desagradables (Suzuki 2011).

 

Els bacteris làctics bons de les cerveses

Els BL són ben coneguts per ser uns dels microbis que més beneficis aporten al camp alimentari, per una banda com a mitjà econòmic de conservar els aliments, i per altra banda per millorar-ne la qualitat i les característiques organolèptiques. Per això són els principals agents dels aliments fermentats, junt amb els llevats. Hem vist alguns dels beneficis alimentaris dels BL en altres posts d’aquest mateix blog: els formatges prehistòrics, o la microbiota de la llet materna, i fins i tot els bacteris del vi.

Així doncs, els BL també tenen el seu bon paper a la producció de les cerveses: en concret, com veurem tot seguit, en la producció de malt acidulat, i en alguns estils peculiars de cervesa com les Làmbic de Bèlgica i la Berliner Weissbier.

Com sabeu, el malt és la matèria primera per fer cerveses. El cereal és sotmès al procés del maltatge, on els grans del cereal -ordi fonamentalment- es fan germinar, els enzims hidrolitzen el midó a sucres, i tot plegat es cou a continuació, obtenint-ne el most, que és la solució substrat per tal que els llevats fermentin i produeixin l’etanol i el carbònic. L’acidificació del malt, o sigui amb un pH més baix, té els avantatges d’activar molts enzims importants al maltatge, i donar una menor viscositat al malt i per tant a la cervesa final. Encara que l’acidificació es pot aconseguir afegint-hi àcids minerals o l’àcid làctic comercial, sovint es recomana o es legisla que l’acidificació sigui biològica, la qual s’aconsegueix afegint-ne BL. La utilització de cultius iniciadors de BL és un procés relativament nou i a més dels beneficis comentats sobre la qualitat del malt, s’ha demostrat que també inhibeix floridures no desitjades que són un problema real al maltatge i que poden donar micotoxines. Els compostos produïts pels BL que poden inhibir els fongs són el mateix àcid làctic i la baixada de pH conseqüent, algunes bacteriocines, peròxid d’hidrogen, i altres compostos no gaire coneguts com potser alguns pèptids (Lowe & Arendt 2004).

Les soques de BL més utilitzades per acidular el malt són de Lactobacillus amylolyticus aïllats prèviament del mateix malt. Aquestes soques de L. amylolyticus són moderament termòfiles, resistents als compostos derivats de l’humulona, i tenen l’avantatge de ser amilolítics a banda de produir l’àcid làctic, que baixa el pH (Vriersekoop et al 2012).

Les cerveses en la fermentació de les quals intervenen BL, com les d’estils Làmbic i Berliner Weissbier, pertanyen al tipus de cerveses de fermentació espontània. Els altres tipus de cerveses de fermentació controlada són, com sabeu, les més conegudes Ale i les Lager, ambdues inoculades amb llevats específics. Les Ale són les de fermentació alta, on el llevat Saccharomyces cerevisiae utilitzat tendeix a romandre a la superfície i la temperatura de fermentació és per damunt de 15ºC i de 20ºC. Les Lager són les de fermentació baixa, originàries històricament de Baviera, on el llevat S. pastorianus (syn. S. carlsbergensis) tendeix a dipositar-se al fons del fermentador i la temperatura és entre 7 i 13ºC.

 

Les cerveses belgues Làmbic

Les cerveses belgues tradicionals d’estil Làmbic (neerlandès lambiek o lambik) són les més conegudes en quant a les seves característiques sensorials degudes a l’activitat dels BL. Són tradicionals de Brussel·les mateix i de la regió veïna de Pajottenland, a la vall de riu Zenne, al Brabant flamenc al SW de la capital belga. Un dels pobles d’aquesta vall és Lembeek, que podria ser l’origen del nom d’aquesta cervesa.

Aquestes cerveses flamenques de fermentació espontània representen l’estil més antic de fer cervesa del món desenvolupat, des de fa uns quants segles. Des de fa pocs anys se n’elaboren cerveses semblants a altres països en petites quantitats, i als EEUU des de 2008 se’n produeixen en força quantitat, les anomenades “American coolship ales” (Ray 2014).

Les cerveses làmbiques s’elaboren amb malta d’ordi i un mínim de 30% de blat no maltejat. Al most s’afegeixen els cons d’un llúpol especial, totalment assecats i envellits durant 3 anys. S’hi afegeixen no tant per al seu aroma o amargor, que justament els envellits en tenen menys, sinó com a antimicrobià, per prevenir sobretot el creixement de bacteris patògens gram-positius al brou de fermentació.

També per evitar aquests contaminants i per afavorir la microbiota pròpia de la fermentació làmbica, aquestes cerveses només es produeixen entre octubre i maig, ja que a l’estiu hi ha massa microorganismes perjudicials a l’aire que podrien espatllar la cervesa, i cal baixar la temperatura després de la bullida. L’ebullició del most es realitza de forma intensiva, amb una evaporació del 30%. Després de la bullida, el brou es deixa en dipòsits oberts, i d’aquesta manera hi són adquirits els microorganismes de l’aire presents a les sales de fermentació de la cerveseria, normalment a la part alta de l’edifici, i de l’aire exterior, ja que la tradició diu que cal deixar les finestres obertes. Se suposa que la microbiota captada és específica de la vall del Zenne. Aquests dipòsits oberts són els koelschip en neerlandès (coolship en anglès), com piscines (Figura 4). En ser ben oberts, amb molta superfície (uns 6 x 6 m) i poca fondària (uns 50 cm), afavoreixen la captació dels microbis de la sala i de l’exterior. Una altra finalitat d’aquesta forma és el refredament més ràpid del brou bullit per iniciar la fermentació. Poden ser de fusta, de coure o d’inoxidable més recentment.

DCIM100GOPROGOPR0641.JPG

Figura 4. Koelschip (en neerlandès) o coolship (en anglès), els dipòsits oberts, com piscines, on s’inicia el procés de la cervesa Làmbic (Brasserie Cantillon, Brussel·les).

 

El brou “inoculat” d’aquesta manera espontània només es deixa una nit als koelschip, i l’endemà aquest most ja es bombeja a tancs de fermentació on hi serà un any, on el contingut en sucres va baixant, fins a uns 30 g/L. Després es transfereix a barriques de roure de les utilitzades prèviament per a xerès o porto, on es pot arribar a deixar uns dos anys més, a unes temperatures de 15-25ºC. Algunes barriques fa 100 anys que s’utilitzen les mateixes. El producte final és una cervesa tèrbola, d’un groc pàl·lid, amb molt poc carbònic, seca, àcida, amb uns 6-8º d’etanol, que recorda una mica al xerès i sobretot a la sidra, i amb un regust lleugerament agre (Jackson 1999).

En aquest llarg procés de fermentació, fins a 3 anys, com és lògic, hi ha una diversitat en la composició de la població microbiana. En una primera fase hi ha una certa predominança de llevats Kloeckera i sobretot d’enterobacteris durant el primer mes. Al cap de 2 mesos ja predominen Pediococcus damnosus i Saccharomycess pp. i comença la fermentació alcohòlica. Després de 6 mesos de fermentació el llevat predominant és Dekkera bruxellensis (Spitaels et al 2014), o el que és el mateix, Brettanomyces (Kumara & Verachtert 1991), del qual Dekkera és la forma sexual.

Fig 5 Spitaels fig3

Figura 5. Espècies dels aïllats en medis d’agar MRS i VRBG, sobretot enterobacteris i bacteris làctics, al llarg del procés d’elaboració d’una cervesa làmbic. El nombre d’aïllats és entre parèntesis (Spitaels et al 2014).

 

Veiem (Figura 5) com en concret a partir dels 2 mesos el bacteri predominant és el bacteri làctic P. damnosus. Aquest fou nomenat als primers estudis com “P. cerevisiae“, però aquest nom finalment no fou admès perquè incloïa altres espècies. El recompte d’aquests en MRS és de 10UFC per mL fins al final de la fermentació. L’acidificació sembla que té lloc ràpidament en la transició de la primera fase a la de maduració, coincidint amb el creixement de P. damnosus, que produeix làctic, encara que Dekkera/Brettanomyces i els bacteris acètics també contribueixen a l’acidificació (Spitaels et al 2014).

En altres assajos amb les American coolship ales (ACA) d’estil làmbic també s’han trobat Lactobacillus spp., i en un estudi metagenòmic (Bukolich et al 2012) amb aquestes ACA s’ha detectat DNA de diversos lactobacil·lals, i al final del procés també s’observa un predomini de Pediococcus (Figura 6, panell C). A la mateixa figura al panell A observem com el fong unicel·lular predominant també és Dekkera/Brettanomyces.

Fig 6 Bukolich fig 2

Figura 6. Anàlisis TRFLP (polimorfismes de longituds de fragments de restricció terminal amplificats per PCR) de DNA total extret de mostres del procés de fermentació de cerveses ACA (similars a les làmbic) durant 3 anys, utilitzant encebadors específics per a: llevats (ITS1/ITS4 del 26S rDNA, panell A);  bacteris (16S rDNA, panell B); i bacteris làctics (panell C). Les mostres senyalades amb * no donaren amplificació. (Bukolich et al 2012)

 

Cerveses derivades de les Làmbic: Gueuze, les afruitades i altres

La làmbic bàsica, tal qual, és difícil d’aconseguir, només es troba a uns pocs cafès de Brussel·les i de la zona de producció. De fet, és la base per elaborar les altres, molt més habituals de consumir:

La Faro és una làmbic endolcida amb sucre moré i a vegades amb espècies.

Les làmbic afruitades són les que se’ls ha afegit fruites senceres o xarop de fruites. Poden ser amb cirera agre (kriek), que són les més tradicionals, o amb gerds, préssec, raïm, maduixa, i en ocasions també de poma o pinya o albercoc o altres.

I finalment, les Gueuze, que són escumoses i fàcils de trobar per al consumidor. S’elaboren barrejant làmbiques joves (de 6 mesos a 1 any) amb altres làmbiques més madures (de 2-3 anys) en ampolles de vidre gruixut semblants a les de xampany o cava i es deixen per a una segona fermentació gràcies als sucres romanents del làmbic jove. Això ho hauria començat a fer un alcalde de Lembeek cap al 1870, que era propietari d’una cerveseria i hi va aplicar les tècniques de fermentació en ampolla que feia alguns anys havien donat bon resultat a la Xampanya (Cervesa en català 2012). La paraula gueuze pot tenir el mateix origen etimològic que gist (llevat en neerlandès) i també podria referir-se a que produeix bombolles del carbònic, o sigui, gas (Jackson 1999). Tanmateix, una altra versió històrica seria que a aquesta cervesa li deien “Lambic de chez le gueux” (làmbic de cal pobre) perquè l’esmentat alcalde de Lembeek tenia idees socialistes semblants a les del “Parti des Gueus” (partit dels captaires) que van fundar els calvinistes de Flandes al segle XVI per lluitar contra l’imperi espanyol. I com que cervesa és femení en francès, el femení de gueux és gueuze, vet aquí (Cervesa en català 2012).

En aquesta refermentació en ampolla es mantenen les poblacions de Dekkera/Brettanomyces i de BL, encara que apareixen en poca quantitat altres fongs unicel·lulars com Candida, Hansenula, Pichia o Cryptococcus (Verachtert & Debourg 1999).

Fig 7 lambics3 swanbournecellars

Figura 7. Diverses cerveses Gueuze i làmbic afruitades, majoritàriament belgues (Foto de www.swanbournecellars.com.au/).

 

La Berliner Weissbier (Figura 8) és una altra cervesa relativament semblant a les Làmbic. També és una cervesa feta amb una part important de most de blat, és tèrbola, àcida i amb un 3% d’etanol. És una clàssica de Berlín i el nord d’Alemanya, elaborada des del s. XVI i que fins a finals del s. XIX era la beguda alcohòlica més popular de Berlín, i que els soldats de Napoleó anomenaven el “xampany del nord”. En la fermentació espontània del most intervenen una barreja de Dekkera/Brettanomyces, Saccharomyces i lactobacils heterofermentatius.

Fig 8 Berliner Weissbier boozedancing_Fotor

Figura 8. La cervesa Berliner Weisse (tret de G-LO, @boozedancing wordpress).

 

Cerveses tipus làmbic fetes a Espanya

De la mateixa manera que recentment es fan les comentades American Coolship Ales, també se’n fan a molts altres països i en el cas d’Espanya, coincidint amb el gust per les cerveses artesanals, també se n’elaboren de tipus làmbic, sobretot de les afruitades. Segons el portal Birrapedia, actualment se n’elaboren 6 d’aquestes, totes de cireres, de les quals dues a les terres de Lleida, una a Barcelona, una a la Marina Alta d’Alacant, una a la vall del Jerte, i una altra a Astúries.

 

Resistència dels bacteris làctics de la cervesa als compostos del llúpol

Lactobacils i pediococs, tant els dolents com els bons que hem vist, i altres bacteris contaminants de les cerveses, tenen la capacitat de resistir els compostos del llúpol, que com hem vist són microbicides naturals. Aquesta resistència pot ser deguda a diversos sistemes de defensa, tant actius com passius (Sakamoto & Konings 2003). Els actius inclouen bombes d’eflux, com HorA i HorC, que transporten els iso-alfa-àcids (Figura 1) cap a fora la cèl·lula.  HorA ho fa amb despesa d’ATP, i HorC mitjançant la força motriu de protons (Figura 9). Els gens corresponents horA i horC foren trobats originalment a L. brevis, però després s’han trobat també a L. lindneri, L. paracollinoides i el més conegut P. damnosus (Suzuki et al 2006).

Curiosament, HorA mostra una semblança del 54% amb OmrA, un transportador de membrana d’Oenococcus oeni, relacionat amb la tolerància d’aquest bacteri del vi a l’etanol i altres factors d’estrés (Bourdineaud et al 2004) (Vegeu alguna cosa més sobre O. oeni al meu post sobre els bacteris de la vinya i el vi). Per tant, és probable que HorA tingui també funcions d’exclusió d’altres compostos a banda dels del llúpol. S’ha vist que aquests gens de resistència horA i horC i les seves regions flanquejants estan molt ben conservades i tenen les seqüències quasi idèntiques a les diferents espècies que les tenen; per tant, és molt probable que unes les hagin adquirit de les altres mitjançant transferència gènica horitzontal, per plasmidis o transposons, com és usual en molts altres bacteris (Suzuki 2011).

Fig 9 brevis Suzuki fig 8

Figura 9. Mecanismes de resistència als compostos del llúpol (Hop) a Lactobacillus brevis (Suzuki 2011).

 

Com veiem a la mateixa Figura 9, els protons entrats són bombejats a fora per una ATPasa, i el consum d’ATPs és compensat formant-ne gràcies al consum de substrats com citrat, malat, piruvat o arginina. Un altre mecanisme de resistència, passiu en aquest cas, és la modificació de la composició d’àcids grassos de membrana, amb la incorporació de més saturats, com el C16:0, disminuint la fluïdesa de membrana i dificultant l’entrada dels compostos del llúpol. Això també ens recorda els canvis de membrana a O. oeni relacionats amb la resistència a etanol (Margalef-Català et al 2016). La paret cel·lular també canvia la seva composició en presència dels alfa-iso-àcids del llúpol, augmentant-ne la quantitat dels lipoteicoic d’alt pes molecular, la qual cosa també faria de barrera. Veiem també (Figura 9) com els compostos del llúpol poden fer disminuir els nivells intracel·lulars de Mn2+, i aleshores s’observa una major síntesi de proteïnes dependents de Mn i una major captació de Mn2+ de l’exterior. Finalment, les cèl·lules de L. brevis quan són a la cervesa redueixen la seva mida (Figura 10), probablement per disminuir la superfície extracel·lular, i així minimitzar l’efecte dels compostos tòxics externs (Suzuki 2011).

Fig 10 brevis mida Suzuki

Figura 10. Efectes de l’adaptació a la cervesa (esquerra) en la mida de les cèl·lules de Lactobacillus brevis en comparació a les crescudes en medi ric MRS (dreta). Les barres fan 5 µm (Suzuki 2011).

 

Tots aquests mecanismes s’han estudiat a soques de L. brevis perjudicials de la cervesa, però se suposa que la resistència que també tenen els bacteris beneficiosos de les làmbiques i altres ha de ser deguda als mateixos mecanismes, ja que són de les mateixes espècies bacterianes.

Com a conclusió de tot el que he comentat, veiem que els bacteris làctics tenen uns papers destacables com a beneficiosos en diversos aspectes de la cerveseria i malteria, malgrat el seu paper més conegut de perjudicials en l’elaboració de les cerveses més habituals.

 

Bibliografia

Birrapedia (vist 18 agost 2018) Cervezas de tipo Fruit Lambic elaboradas en España. https://birrapedia.com/cervezas/del-tipo-fruit-lambic-elaboradas-en-espana

Bokulich NA et al (2012) Brewhouse resident microbiota are responsible for multi-stage fermentation of American Coolship Ale. PLoS One, 7, e35507

Bourdineaud J et al (2004) A bacterial gene homologous to ABC transporters protect Oenococcus oenifrom ethanol and other stress factors in wine. Int J Food Microbiol 92, 1-14.

Cervesa en català (2012) Fitxes de degustació – Timmermans Gueuze Tradition http://cervesaencatala.blogspot.com.es/2012/06/fitxes-de-degustacio-timmermans-gueuze.html

Jackson, Michael (1999) Belgium’s great beers. Beer Hunter Online, july 30, 1999

Kumara HMCS & Verachtert H (1991) Identification of Lambic superattenuating micro-organisms by the use of selective antibiotics. J Inst Brew 97, 181-185

Loret S et al (2005) Levels of biogenic amines as a measure of the quality of the beer fermentation process: data from Belgian samples. Food Chem 89, 519-525

Lowe DP & Arendt EK (2004) The use and effects of lactic acid bacteria in malting and brewing with their relationships to antifungal activity, mycotoxins and gushing: a review. J Inst Brew 110, 163-180

Margalef-Català et al (2016) Protective role of glutathione addition against wine-related stress in Oenococcus oeni. Food Res Int 90, 8-15

Menz G et al (2009) Pathogens in beer, in Beer in Health and Disease Prevention, (Preedy, V. R. Ed.), 403–413, Academic Press, Amsterdam

Ray AL (2014) Coolships rising: the next frontier of sour beers in the U.S.  First we feast 27 feb 2014

Sakamoto K & Konings WN (2003) Beer spoilage bacteria and hop resistance. Int J Food Microbiol 89, 105-124

Spitaels F et al (2014) The microbial diversity of traditional spontaneously fermented lambic beer. PLOS One 9, 4, e95384

Suzuki K et al (2006) A review of hop resistance in beer spoilage lactic acid bacteria. J Inst Brew 112, 173-191

Suzuki K (2011) 125th Anniversary Review: microbiological instability of beer caused by spoilage bacteria. J Inst Brew 117, 131-155

The Beer Wench (2008) My obsession with wild beers. Nov. 20, 2008 https://thecolumbuswench.wordpress.com/tag/lambic/

Verachtert H & Debourg A (1999) The production of gueuze and related refreshing acid beers. Cerevisia, 20, 37–41

Vriesekoop F et al (2012) 125th Anniversary review: Bacteria in brewing: the good, the bad and the ugly. J Inst Brew 118, 335-345

 

Bacillus com a probiòtics

Click here for the English version: Bacillus as probiotics

4 d’agost 2017

Els probiòtics

Els probiòtics són microorganismes vius que, en ingerir-los en quantitats adequades, poden tenir algun efecte positiu sobre la salut dels hostes (FAO/WHO 2006; World Gastroenterology Organisation 2011; Fontana et al. 2013). Els hostes poden ser els humans però també altres animals. Els bacteris làctics, sobretot del gènere Lactobacillus, i els bifidobacteris, ambdós considerats com a GRAS (Generally recognized as safe, generalment reconeguts com a segurs), són els més utilitzats com a probiòtics, però altres bacteris i alguns llevats també poden ser útils. A banda de poder ser administrats com a medicaments, els probiòtics es consumeixen normalment des de fa mil·lennis com una part dels aliments fermentats, com passa amb el iogurt i altres productes làctics (vegeu el meu article “Formatge europeu de fa 7400 anys ….” 26 desembre 2012). Com a medicaments, els probiòtics generalment són venuts sense recepta, de venda lliure a les farmàcies (OTC en anglès, over-the-counter).

Ja he comentat en altres articles d’aquest blog la rellevància dels probiòtics (“Un nou probiòtic activa la microbiota contra el càncer de fetge” 13 juliol 2016), així com de la microbiota que conviu amb el nostre cos (“Bacteris controlant el que mengem” 8 set 2014 ; “Bacteris de la llet materna” 26 gener 2013) i dels altres animals (“Microbiota de la pell humana … i del gos de casa” 17 novembre 2015; “El panda gegant i la seva microbiota…” 26 agost 2015).

A banda dels bacteris làctics i els bifidobacteris, altres microorganismes que també s’utilitzen en certa mesura com a probiòtics són el llevat Saccharomyces cerevisiae, algunes soques d’Escherichia coli, i alguns Bacillus, com ara veurem. També comencen a utilitzar-se alguns clostridials, en relació al que vaig comentar en un article anterior d’aquest mateix blog pel març 2015 (“Tenim clostridis bons al budell….”).

 

Els Bacillus

De fet, els Bacillus i els clostridials tenen en comú la capacitat de formar endòspores. I tots dos grups són grampositius, dins del fílum taxonòmic Firmicutes (Figura 1), que inclou també els bacteris làctics. Tanmateix, els bacil·lals (Bacillus i altres semblants, però també estafilococs i Listeria) són evolutivament més a prop dels lactobacil·lals (els bacteris làctics) que dels clostridials. La principal diferència fisiològica entre Clostridium i Bacillus és que els primers són anaerobis estrictes i Bacillus són aerobis o facultatius.

Fig 1 tree gram + AB

Figura 1. Esquema d’arbre filogenètic dels bacteris grampositius (Firmicutes i Actinobacteris). Elaboració pròpia.

 

Les endòspores bacterianes (Figura 2) són les estructures biològiques més resistents, ja que sobreviuen als ambients inhòspits extrems, com radiacions UV i gamma, dessecació, lisozim, altes temperatures (són la referència per als càlculs d’esterilització tèrmica), falta de nutrients i desinfectants químics. Es troben al terra i a l’aigua, on poden sobreviure durant períodes de temps molt llargs.

Fig 2 bacillus Simon Cutting

Figura 2. Endòspores (les parts blanques) de Bacillus subtilis en formació (Imatge de Simon Cutting).

 

Bacillus als aliments fermentats, sobretot asiàtics

Diversos Bacillus estan implicats clàssicament en els processos de fermentació d’aliments, sobretot per la seva capacitat de producció de proteases, amb la qual cosa durant les fermentacions contribueixen a l’enriquiment nutritiu amb els aminoàcids resultants de la proteòlisi enzimàtica.

Uns d’aquests aliments són els fideus de farina d’arròs fermentada, típics de Tailàndia i Birmània. S’ha vist que en aquesta fermentació intervé una varietat de microorganismes, amb bacteris làctics, llevats i altres fongs, però també bacteris aerobis entre els que hi ha B. subtilis. S’ha trobat que l’activitat proteolítica d’aquests digereix i elimina substrats proteics de l’arròs que són al·lèrgens, com l’azocaseïna, i per tant tenen una activitat beneficiosa per a la salut dels consumidors (Phromraksa et al. 2009).

Tanmateix, l’aliment fermentat amb Bacillus més conegut és la soja fermentada alcalina. Com sabeu, la soja (Glycine max) o faves de soja, són un dels vegetals nutritius més consumits històricament, sobretot als països asiàtics. Se n’obté “llet” de soja, farina de soja, oli de soja, concentrat de soja, iogurt de soja, tofu (llet de soja quallada), i productes fermentats com la salsa de soja, el tempeh, el miso i altres. La majoria d’aquests fermentats es fan amb el fong Rhizopus, afavorint el seu creixement per acidificació o inoculant-lo directament. En canvi, si no s’acidifica i les faves de soja es deixen fermentar només amb aigua, els microbis naturals predominants que ho fermenten són Bacillus, i d’aquesta manera s’obté, entre altres, el “chongkukjang” coreà, el “kinema” de la Índia, el “thua nao” del nord de Taïlàndia, el “douchi” xinès, el “chine pepoke” birmà, i el més conegut, el “natto” japonès (Figura 3). La fermentació espontània amb els Bacillus dona amoni com a subproducte, i per això és alcalina, la qual cosa dóna una olor no gaire bona a molts d’aquests productes, però el natto s’elabora amb un cultiu seleccionat de B. subtilis que hi dóna un olor més suau i agradable (Chukeatirote 2015).

Aquests aliments són bons del punt de vista nutritiu ja que contenen proteïnes, fibra, vitamines, i tot d’origen vegetal o microbià. A més, la publicitat del natto comercial emfatitza, a banda de què és elaborat artesanalment i es ven fresc (no congelat), les seves qualitats probiòtiques, dient que els B. subtilis (Figura 4) que conté promouen la salut gastrointestinal, immunològica, cardiovascular i dels ossos (www.nyrture.com). Diuen que el sabor i la textura del natto són exquisits. Es menja amb arròs o amb altres ingredients i salses, i també dins el maki sushi. Caldrà provar-lo !

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

Figura 3. El “natto”, faves de soja fermentades amb B. subtilis, esmorzar amb arròs, típic japonès (Pinterest.com)

Fig 4 Bs nyrture-com micrograf electro colorejada

Figura 4. Micrografia electrònica colorejada de Bacillus subtilis (Nyrture.com)

 

Bacillus com a probiòtics

Justament les endòspores són el principal avantatge dels Bacillus per ser utilitzats com a probiòtics, gràcies a la seva estabilitat tèrmica i per poder sobreviure les condicions gàstriques (Cutting 2011). Si bé Clostridium també té aquest avantatge, la seva condició d’anaerobi estricte en fa més complexa la seva manipulació, a banda del “mal nom” d’aquest gènere degut a algunes conegudes espècies tòxiques d’aquest gènere.

A diferència d’altres probiòtics com Lactobacillus o Bifidobacterium, les endòspores de Bacillus poden ser emmagatzemades indefinidament sense aigua. Els productes comercials s’administren en dosis d’unes 10^9 espores per gram o per ml.

Cada cop hi ha més productes comercials de probiòtics que contenen Bacillus, tant per a consum humà (Taula 1) com per a ús veterinari (Taula 2). A més a més, també hi ha uns 5 productes específics per a aqüicultura amb diversos Bacillus, i a més sovint les granges de gambes utilitzen els de consum humà (Cutting 2011).

Per a ús en l’aqüicultura s’han obtingut productes probiòtics de barreges de Bacillus (B. thuringiensis, B. megaterium, B. polymixa, B. licheniformis i B. subtilis) aïllant-los de l’intestí de la gamba Penaeus monodon infectada de vibriosis. S’han seleccionat en base a biodegradació de nutrients i a la capacitat inhibitòria del patogen Vibrio harveyi (Vaseeharan & Ramasamy 2003) Són preparats en liòfil o microencapsulades en alginat sòdic, i s’ha comprovat que milloren significativament el creixement i la supervivència de les gambes (Nimrat et al. 2012).

Com veiem per als productes de consum humà, quasi la meitat de les marques (10 de 25) són elaborades al Vietnam. En aquest país l’ús de Bacillus probiòtics està més desenvolupat que en qualsevol altre, però els motius no estan clars. Curiosament allà, com en altres països del sud est asiàtic, no hi ha el concepte de suplements dietètics i els probiòtics com Bacillus només són venuts com a medicaments aprovats pel Ministeri de Salut. Es prescriuen per a la infecció per rotavirus (diarrea infantil) o la estimulació immunològica enfront enverinaments, o són molt freqüentment utilitzats com a teràpia contra infeccions entèriques. Tanmateix, no està clar que s’hagin fet proves clíniques i són productes fàcils de comprar (Cutting 2011).

 

Taula 1. Productes comercials de probiòtics amb Bacillus, per a consum humà (modificat de Cutting 2011).

Producte País del fabricant Espècies de Bacillus
Bactisubtil ® França B. cereus
Bibactyl ® Vietnam B. subtilis
Bidisubtilis ® Vietnam B. cereus
Bio-Acimin ® Vietnam B. cereus i 2 altres
Biobaby ® Vietnam B. subtilis i 2 altres
Bio-Kult ® Regne Unit B. subtilis i 13 altres
Biosporin ® Ucraïna B. subtilis + B. licheniformis
Biosubtyl ® Vietnam B. cereus
Biosubtyl DL ® Vietnam B. subtilis i 1 altre
Biosubtyl I i II ® Vietnam B. pumilus
Biovicerin ® Brasil B. cereus
Bispan ® Corea Sud B. polyfermenticus
Domuvar ® Itàlia B. clausii
Enterogermina ® Itàlia B. clausii
Flora-Balance ® Estats Units B. laterosporus *
Ildong Biovita ® Vietnam B. subtilis i 2 altres
Lactipan Plus ® Itàlia B. subtilis *
Lactospore ® Estats Units B. coagulans *
Medilac-Vita ® Xina B. subtilis
Nature’s First Food ® Estats Units 42 soques, incloent 4 B.
Neolactoflorene ® Itàlia B. coagulans * i 2 altres
Pastylbio ® Vietnam B. subtilis
Primal Defense ® Estats Units B. subtilis
Subtyl ® Vietnam B. cereus
Sustenex ® Estats Units B. coagulans

* Alguns etiquetats com Lactobacillus o altres bacteris porten realment Bacillus

 

Taula 2. Productes comercials de probiòtics amb Bacillus, per a ús veterinari (modificat de Cutting 2011).

Producte Animal País del fabricant Espècies de Bacillus
AlCare ® Porcs Austràlia B. licheniformis
BioGrow ® Pollastres, vedells, porcs Regne Unit B. licheniformis i B. subtilis
BioPlus 2B ® Porcs, pollastres, dindis Dinamarca B. licheniformis i B. subtilis
Esporafeed Plus ® Porcs Espanya B. cereus
Lactopure ® Pollastres, vedells, porcs Índia B. coagulans *
Neoferm BS 10 ® Pollastres, vedells, porcs França B. clausii
Toyocerin ® Vedells, pollastres, conills i porcs Japó B. cereus

 

Les espècies de Bacillus que veiem en aquestes Taules són les que realment s’hi troben, un cop feta la identificació, ja que molts d’aquests productes estan mal etiquetats com a Bacillus subtilis o fins i tot com a Lactobacillus (Green et al. 1999; Hoa et al 2000). Aquests errors en l’etiquetatge poden ser preocupants per al consumidor, i sobretot per qüestions de seguretat, ja que alguns dels trobats són Bacillus cereus, que s’ha vist que pot ser causa d’infeccions gastrointestinals ja que força soques produeixen enterotoxines (Granum & Lund 1997; Hong et al. 2005)

Els possibles Bacillus probiòtics han estat aïllats de diversos orígens. Per exemple recentment se n’han aïllat alguns B. subtilis de l’esmentat chongkukjang coreà, que tenen bones característiques de resistència a les condicions del tracte gastrointestinal (GI) i activitat antimicrobiana contra Listeria, Staphylococcus, Escherichia i fins i tot contra B. cereus (Lee et al 2017).

Un d’aquests productes farmacèutics més coneguts és l’Enterogermina (Figura 5), amb espores de B. subtilis, que és recomanat per al tractament de desordres intestinals associats a alteracions de la microbiota (Mazza 1994).

Figuresv1 copy.ppt

Figura 5. Enterogermina amb espores de Bacillus subtilis (Cutting 2011)

 

Bacillus al tracte gastrointestinal: hi són ? hi poden sobreviure ?

S’ha discutit si les espores administrades poden germinar al tracte GI. Treballant amb ratolins, Casula & Cutting (2002) han utilitzat B. subtilis modificats, amb un gen quimèric ftsH-lacZ, que s’expressa només en cèl·lules vegetatives, amb el que es poden detectar per RT-PCR fins a només 100 bacteris. D’aquesta manera han vist que les espores germinen en nombres significatius al jejú i a l’ili. O sigui, que les espores podrien colonitzar l’intestí prim, encara que transitòriament.

De manera similar, Duc et al. (2004) han conclòs que les espores de B. subtilis poden germinar al budell perquè després del tractament oral dels ratolins, se n’excreten més espores a la femta que les ingerides, senyal que han pogut proliferar. També han detectat, mitjançant RT-PCR, mRNA dels bacils vegetatius després de l’administració de les espores, i a més a més, s’ha observat que el ratolí genera resposta amb IgG contra cèl·lules vegetatives del bacteri. O sigui, que les espores no serien passavolants transitoris, sinó que germinarien passant a cèl·lules vegetatives, les quals tindrien una interacció activa amb les cèl·lules hoste o la microbiota, augmentant-ne l’efecte probiòtic.

Amb tot això, potser caldria considerar a molts Bacillus no com a al·lòctons al tracte GI, sinó com a bacteris amb un cicle de vida bimodal de creixement i esporulació, tant al medi ambient com dins el tracte GI de molts animals (Hong et al. 2005).

En quant a la presència normal de Bacillus a l’intestí, quan s’estudien els diferents microorganismes habitants del digestiu humà per anàlisi metagenòmic del DNA de la microbiota, el gènere Bacillus no apareix (Xiao et al. 2015). Com veiem (Figura 6), els més habituals són Bacteroides i Clostridium, seguits de diversos enterobacteris i altres, inclosos els bifidobacteris.

Fig 6 Xiao nbt.3353-F2

Figura 6. Els 20 gèneres bacterians més abundants a l’intestí d’humans (dreta) i ratolins (esquerra) (Xiao et al. 2015).

 

Malgrat això, s’han aïllat diverses espècies de Bacillus al tracte GI de pollastres, tractant mostres fecals amb calor i etanol per seleccionar només les espores, seguit d’incubació aeròbica (Barbosa et al. 2005). I més en concret, la presència de B. subtilis a la microbiota d’humans s’ha confirmat mitjançant aïllament selectiu en biòpsies d’ili i també de mostres fecals (Hong et al. 2009). Aquestes soques de B. subtilis presentaven gran diversitat i tenien capacitat de formar biofilms, esporular anaeròbiament i secretar antimicrobians, amb la qual cosa es confirma l’adaptació d’aquests bacteris a l’intestí, i per tant poden ser considerats comensals intestinals, i no solament bacteris del sòl.

 

Seguretat dels Bacillus probiòtics

El consum oral de quantitats importants de microorganismes viables que no són molt usuals al tracte GI posa sobre la taula dubtes addicionals sobre la seguretat. Això encara més en l’ús d’espècies que no tenen una història d’utilització segura en aliments, com és el cas dels bacteris esporulats. Fins i tot els habitants normals de l’intestí poden actuar a vegades com a patògens oportunistes (Sanders et al. 2003).

Amb l’excepció de B. anthracis i B. cereus, les diverses espècies de Bacillus generalment no es consideren patogèniques. Per suposat, les espores de Bacillus són consumides de forma usual sense adonar-se’n amb els aliments i en alguns fermentats. Encara que els Bacillus són reconeguts com a GRAS per a la producció d’enzims, fins ara la FDA no ha garantit l’estatus de GRAS per a cap esporulat amb aplicació com a probiòtic, ni Bacillus ni Clostridium. Mentre que Lactobacillus i Bifidobacterium han estat subjecte de nombroses i rigoroses proves de no toxicitat crònica i aguda, i un munt d’experts han revisat dades i han conclòs que són segurs com a probiòtics, no hi han dades de toxicitat publicades sobre Bacillus en relació al seu ús com a probiòtics. En fer un repàs al Medline d’articles on surti el terme “probiotic” limitant-se a estudis clínics, de 123 referències no hi ha cap on surti Bacillus (Sanders et al. 2003).

En canvi, hi ha alguns estudis clínics on soques de Bacillus han estat detectades com a toxigèniques. Tot això explica que alguns productors de Bacillus probiòtics es refereixen a ells amb l’enganyós nom de Lactobacillus sporogenes, espècie inexistent, com es pot comprovar al NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/?term=lactobacillus+sporogenes).

Finalment, cal recordar l’informe conjunt sobre probiòtics de la FAO (Organització de les Nacions Unides per a l’Alimentació i l’Agricultura) i la OMS (Organització Mundial de la Salut) (FAO/WHO 2006), que suggereix un conjunt de directrius per tal que un producte sigui utilitzat com a probiòtic, tant en forma única com en forma de nou suplement alimentari. Aquestes recomanacions són:

  1. Que el microorganisme estigui ben caracteritzat a nivell d’espècie, utilitzant mètodes fenotípics i genotípics (ex. 16S rRNA).
  2. Que la soca en qüestió estigui dipositada en alguna col·lecció de cultius reconeguda internacionalment.
  3. Avaluació de la soca in vitro per determinar-ne l’absència de factors de virulència: que no sigui citotòxica ni envaeixi cèl·lules epitelials, i que no produeixi enterotoxines o hemolisines o lecitinases.
  4. Determinació de la seva activitat antimicrobiana, i el perfil de resistència, incloent l’absència de gens de resistència i la incapacitat per transferir factors de resistència.
  5. Avaluació preclínica de la seva seguretat en models animals.
  6. Confirmació en animals demostrant-ne la seva eficàcia.
  7. Avaluació en humans (Fase I) de la seva seguretat.
  8. Avaluació en humans (Fase II) de la seva eficàcia (si fa l’efecte esperat) i eficiència (amb el mínim de recursos i el mínim temps).
  9. Etiquetatge correcte del producte, incloent gènere i espècie, dosi precisa i condicions de conservació.

FAO WHO

Conclusions

La utilització de Bacillus com a probiòtics, sobretot en forma de suplements dietètics, està augmentant molt ràpidament. Cada cop més estudis científics demostren els seus beneficis, com estimulació immune, activitats antimicrobianes i competència exclusiva. El seu principal avantatge és que poden ser produïts fàcilment i que el producte final, les espores, és molt estable, amb la qual cosa poden ser incorporats fàcilment al menjar quotidià. A més, hi ha estudis que suggereixen que aquests bacteris poden multiplicar-se al tracte GI i poden ser considerats com a residents temporals (Cutting 2011).

D’altra banda, cal demanar un major rigor en la selecció i control dels Bacillus utilitzats, ja que alguns, si no han estat ben identificats, podrien ser causa de trastorns intestinals. En qualsevol cas, donat que el nombre de productes venuts com a probiòtics que contenen els esporulats Bacillus està augmentant molt, cal no donar per suposat que tots són segurs i cal avaluar cas per cas (Hong et al 2005).

 

Bibliografia

Barbosa TM, Serra CR, La Ragione RM, Woodward MJ, Henriques AO (2005) Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 71, 968-978.

Casula G, Cutting SM (2002) Bacillus probiotics: Spore germination in the gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 68, 2344-2352.

Chukeatirote E (2015) Thua nao: Thai fermented soybean. J Ethnic Foods 2, 115-118.

Cutting SM (2011) Bacillus probiotics. Food Microbiol 28, 214-220.

Duc LH, Hong HA, Barbosa TM, Henriques AO, Cutting SM (2004) Characterization of Bacillus probiotics available for human use. Appl Environ Microbiol 70, 2161-2171.

FAO/WHO (2006) Probiotics in food. Health and nutritional properties and guidelines for evaluation. Fao Food and Nutrition Paper 85. Reports of Joint FAO/WHO expert consultations.

Fontana L, Bermudez-Brito M, Plaza-Diaz J, Muñoz-Quezada S, Gil A (2013) Sources, isolation, characterization and evaluation of probiotics. Brit J Nutrition 109, S35-S50.

Granum, P. E., T. Lund (1997) Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Lett. 157:223–228.

Green, D. H., P. R. Wakeley, A. Page, A. Barnes, L. Baccigalupi, E. Ricca, S. M. Cutting (1999) Characterization of two Bacillus probiotics. Appl Environ Microbiol 65, 4288–4291.

Hoa, N. T., L. Baccigalupi, A. Huxham, A. Smertenko, P. H. Van, S. Ammendola, E. Ricca, A. S. Cutting (2000) Characterization of Bacillus species used for oral bacteriotherapy and bacterioprophylaxis of gastrointestinal disorders. Appl Environ Microbiol 66, 5241–5247.

Hong HA, Dic LH, Cutting SM (2005) The use of bacterial spore formers as probiotics. FEMS Microbiol Rev 29, 813-835.

Hong HA, Khaneja R, Tam NMK, Cazzato A, Tan S, Urdaci M, Brisson A, Gasbarrini A, Barnes I, Cutting SM (2009) Bacillus subtilis isolated from the human gastrointestinal tract. Res Microbiol 160, 134-143.

Lee S, Lee J, Jin YI, Jeong JC, Hyuk YH, Lee Y, Jeong Y, Kim M (2017) Probiotic characteristics of Bacillus strains isolated from Korean traditional soy sauce. LWT – Food Sci Technol 79, 518-524.

Mazza P (1994) The use of Bacillus subtilis as an antidiarrhoeal microorganism. Boll Chim. Farm. 133, 3-18.

Nimrat S, Suksawat S, Boonthai T, Vuthiphandchai V (2012) Potential Bacillus probiotics enhance bacterial numbers, water quality and growth during early development of white shrimp (Litopenaeus vannamei). Veterinary Microbiol 159, 443-450.

Phromraksa P, Nagano H, Kanamaru Y, Izumi H, Yamada C, Khamboonruang C (2009) Characterization of Bacillus subtilis isolated from asoian fermented foods. Food Sci Technol Res 15, 659-666.

Sanders ME, Morelli L, Tompkins TA (2003) Sporeformers as human probiotics: Bacillus, Sporolactobacillus, and Brevibacillus. Compr Rev Food Sci Food Safety 2, 101-110

Vaseeharan, B., P. Ramasamy (2003) Control of pathogenic Vibrio spp. by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus monodon. Lett Appl Microbiol 36, 83–87

World Gastroenterology Organisation Global Guidelines (2011) Probiotics and Prebiotics.

Xiao et al. (2015) A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnol 33, 1103-1108.

Fig 0 pinterest-com cool bacillus-subtilis-science-comics

Un nou probiòtic activa la microbiota contra el càncer de fetge

Click here for the english version:  A new probiotic modulates gut microbiota against hepatocellular carcinoma

13 juliol 2016

Els darrers anys s’han anat desvetllant els efectes beneficiosos de la microbiota intestinal humana sobre diversos marcadors de la salut, com la inflamació, la resposta immune, les funcions metabòliques i el pes, així com la importància que tenen aquests bacteris simbiòtics nostres. En relació a la nostra microbiota vegeu per exemple aquests altres posts del meu blog: “Els clostridis bons ens eviten al·lèrgies“, “Bacteris controlant el que mengem” o “Bacteris de la llet materna“.

Al mateix temps s’ha vist que els probiòtics poden ser una bona solució per a moltes malalties amb la microbiota intestinal afectada. Efectivament, s’ha demostrat el paper beneficiós dels probiòtics per tal de reduir la inflamació gastrointestinal i prevenir el càncer colorectal.

Ara bé, recentment s’ha observat que els probiòtics poden tenir efectes beneficiosos en altres parts del cos més enllà del tracte gastrointestinal, en concret amb efectes immunomoduladors sobre un carcinoma hepatocel·lular (CHC). En efecte, investigadors de la Universitat de Hong Kong, juntament amb altres de la Universitat de Finlàndia Oriental, han publicat un estudi (Li et al, PNAS, 2016) en aquest sentit, en el qual han vist reduccions del 40% del pes i mida del tumor CHC del fetge de ratolins als que se’ls havia administrat un nou producte barreja de probiòtics, “Prohep”.

El carcinoma hepatocel·lular (CHC) és el tipus més usual de càncer de fetge, és el 2n càncer més mortal, i força abundant en llocs amb taxes altes d’hepatitis. A més, el fàrmac més utilitzat per reduir la proliferació del tumor, el sorafenib, és caríssim. El cost d’aquest inhibidor multiquinasa és de 3400€, per a les 112 pastilles de 200 mg del tractament recomanat de 4 pastilles al dia durant un mes. En canvi, qualsevol tractament amb probiòtics que s’arribés a demostrar que fos eficaç i pogués substituir aquest fàrmac, seria molt més econòmic.

La nova barreja de probiòtics Prohep està compost per diversos bacteris: Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), i el conjunt inactivat pel calor VSL#3 (1:1:1), que conté Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium breve, Bf. longum, Bf. infantis, Lb. acidophilus, Lb. plantarum, Lb. paracasei, i Lb. delbrueckii.

En el treball esmentat, Li et al. (2016) van alimentar ratolins amb el Prohep durant una setmana abans d’inocular-los un tumor al fetge, i van observar una reducció del 40% del pes i mida del tumor en comparació als animals control. Com veiem a la Figura 1, l’efecte és significatiu als 35 dies, i també per als que se’ls administra el Prohep el mateix dia de la inoculació del tumor. Lògicament, l’efecte de reducció és molt més manifest en administrar un compost antitumoral com Cisplatina.

Aquests investigadors van veure que la reducció del tumor era degut a la inhibició de l’angiogènesi, el procés que fa generar nous vasos sanguinis a partir dels existents, cosa essencial per al creixement tumoral. Relacionat amb la reducció tumoral, van trobar nivells alts del GLUT-1+ hipòxic, o sigui, que al tumor hi havia hipòxia causada pel menor flux sanguini, ja que aquest era un 54% menor, respecte als controls.

 

Fig 1 Li-Fig1B tumor size - days tumor

Figura 1. Variació de mida del tumor. ProPre: administració de Prohep 1 setmana abans d’inoculació del tumor; ProTreat: administració de Prohep el mateix dia d’inoculació del tumor; Cisplatin: administració d’aquest antitumoral. (Fig 1 B de Li et al, 2016).

 

També van determinar que hi havia una menor quantitat del factor angiogènic proinflamatori IL-17 i de les cèl·lules Th17 del sistema immune, que s’associen també al càncer. La menor inflamació i angiogènesi limiten el creixement del tumor.

I a més a més, aquests investigadors van establir que aquests efectes beneficiosos de l’administració dels probiòtics estava relacionats amb l’abundància de bacteris beneficiosos de la microbiota intestinal pròpia dels ratolins, que analitzaren per metagenòmica. O sigui, que els probiòtics modulen la microbiota, afavorint alguns bacteris propis, que són els que produeixen metabòlits antiinflamatoris com la citoquina IL-10 i que suprimeixen la diferenciació de les cèl·lules Th17.

 

Fig 2 gut microbiota Eye of Science

Figura 2. Bacteris de la microbiota intestinal humana al microscopi electrònic de rastreig (SEM) (Imatge colorejada, de Eye of Science / Science Source)

 

Alguns d’aquests bacteris de la microbiota identificats per metagenòmica als ratolins que se’ls havia administrat el Prohep són Prevotella i Oscillibacter. El primer és un bacteri gram-negatiu bacteroidal, que és abundant a la microbiota de nen africans rurals amb dietes riques en carbohidrats. Oscillibacter és un gram-positiu clostridial, que es coneix als humans com a productor del neurotransmissor GABA. Són un exemple més de la importància d’alguns bacteroidals i clostridials en la microbiota intestinal, ja que en són majoria, i malgrat que no són ni molt menys utilitzats com a probiòtics, cada cop se’ls troba més funcions positives, com per exemple evitant al·lèrgies (Els clostridis bons ens eviten al·lèrgies).

Se sap que aquests bacteris produeixen metabòlits antiinflamatoris i per tant serien els principals implicats en regular l’activitat de les cèl·lules immunes que propicien el creixement del tumor. La reducció del tumor observada en aquests experiments amb ratolins seria efecte de l’acció combinada dels mateixos bacteris probiòtics administrats junt amb la microbiota pròpia afavorida per aquests. Veiem un possible esquema d’aquestes accions a la Figura 3.

 

Fig 3 Sung fig 2

Figura 3. Diagrama simplificat dels possibles mecanismes dels bacteris intestinals influint sobre la polarització de les cèl·lules Th17 de la làmina pròpia de la mucosa intestinal. Els bacteris de la microbiota activarien les cèl·lules dendrítiques, les quals segreguen citoquines (IL-22, IL-23, IL-27). Els bacteris poden promoure la immunitat de Th17 induint IL-23, que pot estar involucrada mitjançant la senyal de lligands TLR, o ATP extracel·lular o l’amiloide A sèric (SAA). Mentrestant, algunes soques probiòtiques podrien inhibir el desenvolupament de Th17 per la via de la producció de IL-12 i IL-27, a banda d’afavorir el creixement i colonització dels bacteris propis que indueixen Th17 (Sung et al 2012, Fig. 2).

 

Encara que ja sabem que la progressió dels càncers és un procés molt complex, i que als microambients del tumor hi ha una infiltració de molts diversos tipus de cèl·lules del sistema immunitari com cèl·lules T, neutròfils, cèl·lules killer, macròfags, etc, la subpoblació de cèl·lules helper Th17 sembla que és prevalent en la progressió dels tumors, i per tant, aquests efectes dels probiòtics i la microbiota obren bones perspectives.

Encara és aviat per dir si aquests descobriments contribuiran a un tractament del càncer de fetge humà, i per tant calen investigacions en humans per veure si aquests probiòtics podrien ser utilitzats com a tal o en tàndem amb algun fàrmac, en funció del estadi i mida del tumor. En qualsevol cas, s’obre un nou ventall de possibilitats de recerca dels mecanismes moleculars dels efectes beneficiosos dels probiòtics més enllà del tracte intestinal.

 

Bibliografia

El-Nezami H (2016 april 27) HKU develops novel probiotic mixture “Prohep” that may offer potential therapeutic effects on liver cancer. The University of Hong Kong (HKU) 27 Apr 2016

El-Nezamy H, Lee PY, Huang J, Sung YJ (2015) Method and compositions for treating cancer using probiotics. Patent WO 2015021936 A1

Li J, Sung CYJ, Lee N, Ni Y, Pihlajamäki J, Panagiotou G, El-Nezami H (2016) Probiotics modulated gut microbiota suppresses hepatocellular carcinoma growth in mice. PNAS E1306-E1315

Oelschlaeger TA (2010) Mechanisms of probiotic actions – A review. Int J Med Microbiol 300, 57-62

Packham C (2016) Probiotics dramatically modulate liver cancer growth in mice. Medical Press, Med Research 23 Feb 2016

Silgailis M (2016) Treating some cancers with probiotics in the future ? Probiotic Prohep. Lacto Bacto: Health, Microbes and More 23 Feb 2016

Sung CYJ, Lee NP, El-Nezami H (2012) Regulation of T helper by bacteria: an approach for the treatment of hepatocellular carcinoma. Int J Hepatology ID439024, doi:10.1155/2012/439024

UEF News and Events (2016) A novel probiotic mixture may offer potential therapeutic effects on hepatocellular carcinoma. University of Eastern Finland 1 Mar 2016

 

Els bacteris de la vinya i del “terroir”, i presència d’Oenococcus als raïms del Priorat

Click here for the english version: Bacteria of vineyard and terroir, and presence of Oenococcus in Priorat (South Catalonia) grapes

22 abril 2015 

Els viticultors creuen que la terra en la qual creixen les vinyes dóna una qualitat única als seus vins, i d’això en diuen el terroir, o terrer si ho traduïm al català. Es pot considerar que la resposta fisiològica de les vinyes al tipus de sòl i les condicions climàtiques, juntament amb les característiques de la varietat i la forma de cultiu, donen lloc a unes propietats organolèptiques del vi que defineixen el seu terroir (Zarraonaindia et al 2015). Ara bé, no es coneix gaire si hi podria haver una microbiota específica de cada terroir, ja que aquest tema s’ha estudiat relativament poc.

Els microorganismes vínics als raïms ? Saccharomyces no hi és o no se’l troba

Els principals protagonistes de les fermentacions víniques, la alcohòlica (Saccharomyces cerevisiae) i la malolàctica (Oenococcus oeni) normalment no apareixen fins que el most està fermentant, ja doncs al celler. En condicions normals de raïms sans, pràcticament no es troba S. cerevisiae.

Oenococcus oeni als raïms ? Em sembla que nosaltres l’hem trobat !

En quant a O. oeni, fins ara s’ha publicat molt poc sobre la seva presència i aïllament en els raïms. En diversos treballs, com Sieiro et al (1990), o més recentment Bae et al (2006), ja havien aïllat alguns bacteris làctics de la superfície de raïms, però no O. oeni. Només Garijo et al (2011) van aconseguir aïllar una colònia (una només) d’O. oeni a partir de raïms de la Rioja. D’altra banda, s’ha detectat el DNA d’O. oeni en alguna mostra de raïms de Bordeus (Renouf et al 2005, Renouf et al 2007) per PCR-DGGE del gen rpoB, encara que no van aïllar cap bacteri d’aquesta espècie.

Em plau poder comentar que recentment al nostre grup hem aconseguit aïllar O. oeni dels raïms i tipificar-ne diverses soques, i justament estem elaborant una publicació al respecte (Franquès et al 2015). Efectivament, l’equip de recerca de bacteris làctics BL-URV, junt amb els companys de llevats del mateix grup de Biotecnologia Enològica (Facultat d’Enologia de la Universitat Rovira i Virgili a Tarragona) estem treballant en un projecte europeu, el “Wildwine” (FP7-SME-2012 -315065), que té per objectius analitzar els microorganismes autòctons (d’aquí lo de “wild”) del sistema vitivinícola del Priorat, i seleccionar-ne soques amb potencial enològic. Al projecte també hi participen la DOQ Priorat i el celler Ferrer-Bobet, així com grups de recerca i associacions de cellers de Bordeus, el Piemont i Grècia. En el marc d’aquest projecte vam prendre mostres de raïms (garnatxa i carinyena) de diverses finques del Priorat (Figura 1), així com també de vins realitzant la fermentació malolàctica, i en vam obtenir uns 1900 aïllats de bacteris làctics. Vam optimitzar l’aïllament a partir dels raïms a partir de la polpa i del most amb diversos mètodes d’enriquiment, i així vam obtenir uns 110 aïllats de raïms, identificats com O. oeni per tècniques moleculars específiques. Un cop tipificats, hem comprovat que els seus perfils moleculars no coincideixen amb soques comercials i per tant són autòctones. A més, alguns d’aquests aïllats dels raïms també els hem trobat als vins fets als cellers corresponents.

Fig 1 garna-cari Priorat

Figura 1. Prenent mostres de garnatxa (esquerra) i carinyena (dreta) de finques del Priorat per tal d’aïllar bacteris làctics com Oenococcus (Fotos Albert Bordons).


La microbiota dels raïms

Els raïms tenen una ecologia microbiana complexa que inclou llevats, fongs micelials i bacteris. Alguns només es troben als raïms, com els fongs paràsits i els bacteris ambientals, i altres tenen la capacitat de sobreviure i créixer als vins: sobretot llevats, bacteris làctics i bacteris acètics. La proporció de tots plegats depèn de l’estat de maduració del raïm i de la disponibilitat de nutrients.

Quan els fruits són intactes, la microbiota predominant són els llevats basidiomicets com Cryptococcus i Rhodotorula, però quan són més madurs, comencen a tenir microfisures que faciliten la disponibilitat de nutrients i expliquen la predominança just abans de la verema d’ascomicets lleugerament fermentatius com Candida, Hanseniaspora, Metschnikowia i Pichia. Quan la pell ja està més danyada poden aparèixer llevats perjudicials com Zygosaccharomyces i Torulaspora, i bacteris acètics. Entre els fongs filamentosos poden haver-hi ocasionalment alguns molt perjudicials com Botrytis (la podridura) o Aspergillus productors d’ocratoxina, que encara que només són actius a la vinya, els seus productes poden afectar la qualitat del vi.

D’altra banda, a la superfície dels raïms s’han aïllat bacteris ubics ambientalment com diversos enterobacteris, Bacillus, i estafilococs, però cap d’ells pot créixer al vi (Barata et al 2012).

Tornant a la possible microbiota específica del terroir, s’ha vist que alguns compostos volàtils que contribueixen a l’aroma del vi, com 2-metil-butanoic o 3-metil-butanol, són produïts per microorganismes aïllats a les vinyes, com el bacteri grampositiu Paenibacillus, o el fong basidiomicet Sporobolomyces o l’ascomicet Aureobasidium. Per tant, podria haver una relació entre algunes de les espècies microbianes trobades a la vinya i alguns aromes detectats al vi, procedents del most, és clar (Verginer et al 2010).

La metagenòmica com a eina analítica de la microbiota dels raïms

Donat que els mètodes clàssics d’aïllament i cultiu dels microorganismes són lents, laboriosos i alguns dels microbis no s’aconsegueix fer-los créixer en els medis d’aïllament, actualment es recorre als mètodes de seqüenciació massiva o metagenòmica. Aquests consisteixen en analitzar el DNA present i a partir de les seqüències, deduir amb les bases de dades quins són els microorganismes presents a la mostra. En el cas dels bacteris sovint s’utilitza el DNA amplificat del fragment V4 del gen 16S RNA (Caporaso et al 2012).

S’ha utilitzat en mostres de vins botrititzats (Bokulich et al 2012) i s’han trobat proporcions de diversos bacteris làctics (però no Oenococcus), inclosos alguns no associats normalment a vi. També s’ha utilitzat per veure la microbiota resident als cellers i com canvia segons les estacions, comprovant que a les superfícies dels dipòsits i maquinària del celler hi ha una majoria de microorganismes no relacionats amb el vi ni tampoc perjudicials (Bokulich 2013).

Amb aquesta tècnica Bokulich et al (2014) també han analitzat els raïms i han vist diferències clares entre les proporcions dels diversos grups bacterians (i de fongs) entre diferents llocs, diferents varietats, i també segons les condicions ambientals o biogeogràfiques. Per exemple, en analitzar 273 mostres de mostos de raïms de Califòrnia, les 3 varietats (Cabernet, Chardonnay i Zinfandel) queden bastant discriminades en una anàlisi de components principals respecte a les comunitats bacterianes trobades a cada mostra (Figura 2).

Així doncs, els grups o taxons bacterians dominants en una varietat o ambient determinat podrien aportar unes característiques específiques en aquells vins, i això podria explicar alguns patrons regionals o de terroir en les propietats organolèptiques d’aquests vins (Bokulich et al 2014).

Fig 2 ACP Bokulich 2014

Figura 2. Anàlisi de components principals de les comunitats bacterianes de mostres de mostos de raïms de Sonoma (Califòrnia) de 3 varietats diferents (Cabernet en vermell, Chardonnay en verd i Zinfandel en blau) (Bokulich et al 2014).


Nosaltres també hem realitzat un estudi de seqüenciació massiva amb les mostres de raïms de les quals hem obtingut aïllats d’O. oeni, com he comentat abans (Franquès et al 2015), i en més 600.000 seqüències del rRNA 16S analitzades hem trobat sobretot Proteobacteris i Firmicutes. Entre aquests grampositius, hem trobat seqüències de bacteris làctics (un 15%) i d’aquests hem pogut confirmar amb èxit la presència d’O. oeni en un 5% de les seqüències. Per tant, hem aïllat O. oeni dels raïms i n’hem detectat el seu DNA en força mostres.

La microbiota bacteriana de tota la vinya i del sòl

Com veiem, s’ha estudiat una mica la microbiota dels raïms i dels vins, però molt menys la microbiota dels sòls, la qual pot definir més bé el terroir, que està influït pel clima local i les característiques de la vinya.

Veiem a la Figura 3 un resum dels principals gèneres trobats a les diferents parts de la vinya i al sòl (Gilbert et al 2014).

Fig 3 Gilbert 2014

Figura 3. Principals bacteris i fongs associats als òrgans i sòl de Vitis vinifera (Gilbert et al 2014)


Recentment s’ha publicat un treball interessant (Zarraonaindia et al 2015) sobre aquest tema, amb l’objectiu de veure si el sòl podria ser la principal font de bacteris que colonitzen els raïms. Han agafat mostres de sòl, arrels, fulles, raïms i flors de Merlot, de diferents terrenys i anys, de Suffolk, Nova York, i n’han analitzat el DNA dels bacteris presents mitjançant seqüenciació del 16S rRNA. Han trobat que un 40% de les espècies trobades són presents a totes les mostres de sòls i arrels, mentre que en fulles i fruits hi ha més variabilitat, i a més un 40% de les trobades en fulles i fruits també apareixen a les mostres de sòls. Tot plegat suggereix que molts dels bacteris s’originen al sòl.

En quant als tipus de bacteris presents, com veiem (Figura 4), predominen els Proteobacteris (sobretot Pseudomonas i Methylobacterium), principalment a les parts aèries de la planta. També hi han Firmicutes lògicament, i Acidobacteria i Bacteroides.

Fig 4 microbiota vineyard

Figura 4. Composició de la comunitat bacteriana, a nivell taxonómic de fílum, en mostres de diferents òrgans de la vinya i el seu sòl (Zarraonaindia et al 2015).


Encara que s’observen variacions en totes les mostres en funció de l’any (poden tenir diferents condicions climàtiques) i en funció de factors edàfics diferents (pH, C:N, humitat), com veiem (Figura 5) les anàlisis de components principals demostren que els tipus de mostres (sòl, arrels, fulles, raïms) es diferencien força bé, i mostres de mostos abans de fermentar queden semblants a les de raïms.

Fig 5 distribució grups mostres OTUs

Figura 5. Anàlisi de components principals mostrant les semblances en quant a la composició dels grups taxonòmics presents, entre tots els tipus de mostres, incloent-ne de mostos (Zarraonaindia et al 2015).


Això suggereix que la comunitat bacteriana present als raïms roman relativament estable fins al most, i si més no, més estable que les diferències entre òrgans. Al mateix temps, una part important dels representants dels fílums bacterians dels raïms vindrien del sòl. Això es pot explicar perquè en fer la verema manual els raïms sovint són situats en caixes que es deixen a terra, o bé si es fa verema mecànica, la maquinària utilitzada remou el terra i genera pols, que pot colonitzar els raïms.

Per tant, la microbiota del sòl és una font de bacteris associats a la vinya i pot tenir un paper en el most, i per tant en la vinificació, i potencialment en la formació de les característiques del terroir. Alguns d’aquest bacteris poden tenir papers no coneguts de productivitat o de resistència a malalties de la planta, o contribuir a les característiques organolèptiques del vi (Zarraonaindia et al 2015).

A banda d’això, i pensant en els microorganismes vínics, responsables de les fermentacions, com he comentat, al nostre laboratori hem pogut confirmar que als raïms hi ha algunes soques d’Oenococcus oeni i ho hem corroborat amb la detecció del seu DNA als mateixos raïms.


Bibliografia

Bae S, Fleet GH, Heard GM (2006) Lactic acid bacteria associated with wine grapes from several Australian vineyards. J Appl Microbiol 100, 712-727

Barata A, Malfeito-Ferreira M, Loureiro V (2012) The microbial ecology of wine grapes (Review). Int J Food Microbiol 153, 243-259

Bokulich NA, Joseph CML, Allen G, Benson AK, Mills DA (2012) Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine. Plos One 7, e36357

Bokulich NA, Ohta M, Richardson PM, Mills DA (2013) Monitoring seasonal changes in winery-resident microbiota. Plos One 8, e66437

Bokulich NA, Thorngate JH, Richardson PM, Mills DA (2014) Microbial biogeography of wine grapes is conditioned by cultivar, vintage, and climate. PNAS nov 25, E139-E148

Caporaso JG, Lauber CL, Walters WA, Berg-Lyons D, Huntley J, Fierer N, Owens SM, Betley J, Fraser L, Bauer M, Gormley N, Gilbert JA, Smith G, Knight R (2012) Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J 6, 1621–1624

Franquès J, Araque I, Portillo C, Reguant C, Bordons A (2015) Presence of autochthonous Oenococcus oeni in grapes and wines of Priorat in South Catalonia. Article en elaboració.

Garijo P, Lçopez R, Santamaría P, Ocón E, Olarte C, Sanz S, Gutiérrez AR (2011) Eur Food Res Technol 233, 359-365

Gilbert JA, van der Lelie D, Zarraonaindia I (2014) Microbial terroir for wine grapes. PNAS 111, 5-6

Renouf V, Claisse O, Lonvaud-Funel A (2005) Understanding the microbial ecosystem on the grape berry surface through numeration and identification of yeast and bacteria. Aust J Grape Wine Res 11, 316-327

Renouf V, Claisse O, Lonvaud-Funel A (2007) Inventory and monitoring of wine microbial consortia. Appl Microbiol Biotechnol 75, 149-164

Sieiro C, Cansado J, Agrelo D, Velázquez JB, Villa TG (1990) Isolation and enological characterization of malolactic bacteria from the vineyards of Northwestern Spain. Appl Environ Microbiol 56, 2936-2938

Verginer M, Leitner E, Berg G (2010) Production pf volatile metabolites by grape-associated microorganisms. J Agric Food Chem 58, 8344-8350

Lluís Rabell

Activista, polític, company

Blog Cátedra de Historia y Patrimonio Naval

“Quien domina el mar, domina todas las cosas” (Temístocles)

No sé ni cómo te atreves

Fotografía y esas pequeñas cosas de cada día

Life Secrets

For my students

Horitzons llunyans

Mirades distants

#4wine

Los vinos son pequeñas historias dentro de una botella y nosotras queremos contarte las nuestras

Vi·moments·persones

Un maridatge a tres bandes

SciLogs: Artificial, naturalmente

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

microBIO

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

RealClimate

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

Quèquicom

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

Dionís de viatge a Ítaca

Experiències enoturístiques

A %d bloguers els agrada això: