Category Archives: Genètica i biologia molecular

Un nou probiòtic activa la microbiota contra el càncer de fetge

Click here for the english version:  A new probiotic modulates gut microbiota against hepatocellular carcinoma

13 juliol 2016

Els darrers anys s’han anat desvetllant els efectes beneficiosos de la microbiota intestinal humana sobre diversos marcadors de la salut, com la inflamació, la resposta immune, les funcions metabòliques i el pes, així com la importància que tenen aquests bacteris simbiòtics nostres. En relació a la nostra microbiota vegeu per exemple aquests altres posts del meu blog: “Els clostridis bons ens eviten al·lèrgies“, “Bacteris controlant el que mengem” o “Bacteris de la llet materna“.

Al mateix temps s’ha vist que els probiòtics poden ser una bona solució per a moltes malalties amb la microbiota intestinal afectada. Efectivament, s’ha demostrat el paper beneficiós dels probiòtics per tal de reduir la inflamació gastrointestinal i prevenir el càncer colorectal.

Ara bé, recentment s’ha observat que els probiòtics poden tenir efectes beneficiosos en altres parts del cos més enllà del tracte gastrointestinal, en concret amb efectes immunomoduladors sobre un carcinoma hepatocel·lular (CHC). En efecte, investigadors de la Universitat de Hong Kong, juntament amb altres de la Universitat de Finlàndia Oriental, han publicat un estudi (Li et al, PNAS, 2016) en aquest sentit, en el qual han vist reduccions del 40% del pes i mida del tumor CHC del fetge de ratolins als que se’ls havia administrat un nou producte barreja de probiòtics, “Prohep”.

El carcinoma hepatocel·lular (CHC) és el tipus més usual de càncer de fetge, és el 2n càncer més mortal, i força abundant en llocs amb taxes altes d’hepatitis. A més, el fàrmac més utilitzat per reduir la proliferació del tumor, el sorafenib, és caríssim. El cost d’aquest inhibidor multiquinasa és de 3400€, per a les 112 pastilles de 200 mg del tractament recomanat de 4 pastilles al dia durant un mes. En canvi, qualsevol tractament amb probiòtics que s’arribés a demostrar que fos eficaç i pogués substituir aquest fàrmac, seria molt més econòmic.

La nova barreja de probiòtics Prohep està compost per diversos bacteris: Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), i el conjunt inactivat pel calor VSL#3 (1:1:1), que conté Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium breve, Bf. longum, Bf. infantis, Lb. acidophilus, Lb. plantarum, Lb. paracasei, i Lb. delbrueckii.

En el treball esmentat, Li et al. (2016) van alimentar ratolins amb el Prohep durant una setmana abans d’inocular-los un tumor al fetge, i van observar una reducció del 40% del pes i mida del tumor en comparació als animals control. Com veiem a la Figura 1, l’efecte és significatiu als 35 dies, i també per als que se’ls administra el Prohep el mateix dia de la inoculació del tumor. Lògicament, l’efecte de reducció és molt més manifest en administrar un compost antitumoral com Cisplatina.

Aquests investigadors van veure que la reducció del tumor era degut a la inhibició de l’angiogènesi, el procés que fa generar nous vasos sanguinis a partir dels existents, cosa essencial per al creixement tumoral. Relacionat amb la reducció tumoral, van trobar nivells alts del GLUT-1+ hipòxic, o sigui, que al tumor hi havia hipòxia causada pel menor flux sanguini, ja que aquest era un 54% menor, respecte als controls.

 

Fig 1 Li-Fig1B tumor size - days tumor

Figura 1. Variació de mida del tumor. ProPre: administració de Prohep 1 setmana abans d’inoculació del tumor; ProTreat: administració de Prohep el mateix dia d’inoculació del tumor; Cisplatin: administració d’aquest antitumoral. (Fig 1 B de Li et al, 2016).

 

També van determinar que hi havia una menor quantitat del factor angiogènic proinflamatori IL-17 i de les cèl·lules Th17 del sistema immune, que s’associen també al càncer. La menor inflamació i angiogènesi limiten el creixement del tumor.

I a més a més, aquests investigadors van establir que aquests efectes beneficiosos de l’administració dels probiòtics estava relacionats amb l’abundància de bacteris beneficiosos de la microbiota intestinal pròpia dels ratolins, que analitzaren per metagenòmica. O sigui, que els probiòtics modulen la microbiota, afavorint alguns bacteris propis, que són els que produeixen metabòlits antiinflamatoris com la citoquina IL-10 i que suprimeixen la diferenciació de les cèl·lules Th17.

 

Fig 2 gut microbiota Eye of Science

Figura 2. Bacteris de la microbiota intestinal humana al microscopi electrònic de rastreig (SEM) (Imatge colorejada, de Eye of Science / Science Source)

 

Alguns d’aquests bacteris de la microbiota identificats per metagenòmica als ratolins que se’ls havia administrat el Prohep són Prevotella i Oscillibacter. El primer és un bacteri gram-negatiu bacteroidal, que és abundant a la microbiota de nen africans rurals amb dietes riques en carbohidrats. Oscillibacter és un gram-positiu clostridial, que es coneix als humans com a productor del neurotransmissor GABA. Són un exemple més de la importància d’alguns bacteroidals i clostridials en la microbiota intestinal, ja que en són majoria, i malgrat que no són ni molt menys utilitzats com a probiòtics, cada cop se’ls troba més funcions positives, com per exemple evitant al·lèrgies (Els clostridis bons ens eviten al·lèrgies).

Se sap que aquests bacteris produeixen metabòlits antiinflamatoris i per tant serien els principals implicats en regular l’activitat de les cèl·lules immunes que propicien el creixement del tumor. La reducció del tumor observada en aquests experiments amb ratolins seria efecte de l’acció combinada dels mateixos bacteris probiòtics administrats junt amb la microbiota pròpia afavorida per aquests. Veiem un possible esquema d’aquestes accions a la Figura 3.

 

Fig 3 Sung fig 2

Figura 3. Diagrama simplificat dels possibles mecanismes dels bacteris intestinals influint sobre la polarització de les cèl·lules Th17 de la làmina pròpia de la mucosa intestinal. Els bacteris de la microbiota activarien les cèl·lules dendrítiques, les quals segreguen citoquines (IL-22, IL-23, IL-27). Els bacteris poden promoure la immunitat de Th17 induint IL-23, que pot estar involucrada mitjançant la senyal de lligands TLR, o ATP extracel·lular o l’amiloide A sèric (SAA). Mentrestant, algunes soques probiòtiques podrien inhibir el desenvolupament de Th17 per la via de la producció de IL-12 i IL-27, a banda d’afavorir el creixement i colonització dels bacteris propis que indueixen Th17 (Sung et al 2012, Fig. 2).

 

Encara que ja sabem que la progressió dels càncers és un procés molt complex, i que als microambients del tumor hi ha una infiltració de molts diversos tipus de cèl·lules del sistema immunitari com cèl·lules T, neutròfils, cèl·lules killer, macròfags, etc, la subpoblació de cèl·lules helper Th17 sembla que és prevalent en la progressió dels tumors, i per tant, aquests efectes dels probiòtics i la microbiota obren bones perspectives.

Encara és aviat per dir si aquests descobriments contribuiran a un tractament del càncer de fetge humà, i per tant calen investigacions en humans per veure si aquests probiòtics podrien ser utilitzats com a tal o en tàndem amb algun fàrmac, en funció del estadi i mida del tumor. En qualsevol cas, s’obre un nou ventall de possibilitats de recerca dels mecanismes moleculars dels efectes beneficiosos dels probiòtics més enllà del tracte intestinal.

 

Bibliografia

El-Nezami H (2016 april 27) HKU develops novel probiotic mixture “Prohep” that may offer potential therapeutic effects on liver cancer. The University of Hong Kong (HKU) 27 Apr 2016

El-Nezamy H, Lee PY, Huang J, Sung YJ (2015) Method and compositions for treating cancer using probiotics. Patent WO 2015021936 A1

Li J, Sung CYJ, Lee N, Ni Y, Pihlajamäki J, Panagiotou G, El-Nezami H (2016) Probiotics modulated gut microbiota suppresses hepatocellular carcinoma growth in mice. PNAS E1306-E1315

Oelschlaeger TA (2010) Mechanisms of probiotic actions – A review. Int J Med Microbiol 300, 57-62

Packham C (2016) Probiotics dramatically modulate liver cancer growth in mice. Medical Press, Med Research 23 Feb 2016

Silgailis M (2016) Treating some cancers with probiotics in the future ? Probiotic Prohep. Lacto Bacto: Health, Microbes and More 23 Feb 2016

Sung CYJ, Lee NP, El-Nezami H (2012) Regulation of T helper by bacteria: an approach for the treatment of hepatocellular carcinoma. Int J Hepatology ID439024, doi:10.1155/2012/439024

UEF News and Events (2016) A novel probiotic mixture may offer potential therapeutic effects on hepatocellular carcinoma. University of Eastern Finland 1 Mar 2016

 

Microbiota de la pell humana, en part compartida amb el gos de casa

Click here for the english version: Human skin microbiota partly shared with the dog

17 novembre 2015

Diversitat de la microbiota humana a les diferents parts del cos i entre individus

Com havia comentat en altres posts anteriors d’aquest blog (Clostridis bons del budell 1 març 2015; Bacteris controlant el que mengem 8 set 2014; Bacteris de la llet materna 26 gener 2013), cada cop es fa més patent la importància que té la microbiota del nostre cos, o sigui el conjunt de microorganismes, sobretot bacteris, amb els quals convivim.

La microbiota humana varia d’un individu a un altre, en relació a la dieta, l’edat i les característiques fenotípiques i genètiques de cadascú. I a més, com que no vivim aïllats, també hi influeix l’entorn, o sigui les altres persones amb les que interactuem, i és clar, els altres animals amb que convivim, com els gossos i altres animals domèstics. Tots plegats també tenen microbiota pròpia.

El cos humà és la llar de molts microorganismes diferents, amb bacteris (i arquees), fongs i virus que viuen a la pell, a l’intestí i en diversos altres llocs en el cos (Figura 1). Si bé molts d’aquests microbis són beneficiosos als seus hostes humans, sabem poc sobre la majoria d’ells. Les primeres investigacions es van centrar en la comparació dels microorganismes que es troben en individus sans amb els que es troben en les persones que pateixen d’una malaltia en particular. Més recentment els investigadors s’han interessat en les qüestions més generals, com entendre com s’estableix aquesta microbiota i conèixer les causes de les similituds i diferències entre la microbiota de diferents individus.

 

Fig 1 Marsland

Figura 1. Proporcions de tipus de microorganismes que habiten a les diferents parts del cos humà: bacteris (cercles grans), fongs (cercles petits dreta) i virus (cercles petits esquerra) (Marsland & Gollwitzer 2014)

 

Ara ja se sap que les comunitats de microorganismes que es troben en els intestins de les persones relacionades genèticament tendeixen a ser més similars que els de les persones que no estan relacionades. D’altra banda, les comunitats microbianes que es troben en els intestins dels adults no relacionats que viuen a la mateixa llar són més similars que les dels adults no relacionats que viuen en diferents llars (Yatsunenko et al 2012). No obstant això, tots aquests estudis s’han centrat en l’intestí, i poc se sap sobre l’efecte de la relació, la convivència i l’edat en la microbiota en altres parts del cos, com és el cas de la pell.

 

Microbiota de la pell humana

La pell és un ecosistema d’uns 1,8 m2 de diversos hàbitats, amb plecs, invaginacions i nínxols especialitzats que acullen molts tipus de microorganismes. La funció principal de la pell és com a barrera física, protegint el cos d’assalts potencials per part d’organismes estranys o substàncies tòxiques. Com que també és la interfase amb l’ambient extern, està colonitzat per diversos microorganismes, incloent bacteris, fongs, virus, així com àcars (Figura 2). A la superfície destaquen proteobacteris, propionibacteris i estafilococs i alguns fongs com Malassezia (un basidiomicet amb un estadi unicel·lular i un altre micelià). Els àcars (en anglès mites) com Demodex folliculorum viuen al voltant dels fol·licles pilosos. Molts d’aquests microorganismes són innocus i a vegades aporten funcions vitals que el genoma humà no ha adquirit evolutivament. Els microorganismes simbiòtics protegeixen front a altres microbis patogènics o nocius. (Grice & Segre 2011).

Fig 2 Grice

Figura 2. Esquema de secció de pell humana amb els diversos microorganismes presents (Grice & Segre 2011).

 

En conseqüència amb la comentada diversitat de la microbiota, aquesta també és molt variada segons la regió de la pell que considerem (Figura 3), i per tant segons els diversos microambients, que com veiem poden ser de 3 característiques diferents: sebacis o oliosos, humits i secs.

Fig 3 Grice

Figura 3. Distribució topogràfica dels tipus de bacteris en diferents llocs de la pell (Grice & Segre 2011)

 

La pell és un complex entramat estructural, hormonal, nerviós, immunològic i microbià i en aquest sentit s’ha comprovat que la microbiota resident col·labora amb el sistema immune, especialment en la reparació de les ferides (Figura 4). Com veiem, en concret l’àcid lipoteicoic (LTA), integrant de la paret cel·lular bacteriana, alliberat per Staphylococcus epidermidis, estimula els receptors tipus Toll (Toll-Like Receptor) TLR2, que indueixen la producció de pèptids antimicrobians, i també s’estimulen els queratinòcits de l’epidermis via els TLR3 per desencadenar l’inflamació, amb producció d’interleucina i atracció de leucòcits (Heath & Carbone 2013). Tot plegat per assegurar la protecció homeostàtica i la defensa enfront possibles patògens. Més informació també a la revisió de Belkaid & Segre (2014).

Fig 4 Heath Fig1 ni.2680-F1

Figura 4. Contribució de la microbiota resident a la immunitat i la reparació de ferides (Heath & Carbone 2013)

 

A casa compartim microbiota, i amb el gos

Com dèiem al principi, l’entorn influeix en la microbiota d’un individu, i per tant, individus que viuen junts tendeixen a compartir part de la microbiota. Efectivament, això fou recentment estudiat per Song et al (2013), amb 159 persones i 36 gossos de 60 famílies (unitats conjugals amb nens i/o gossos). Els van estudiar la microbiota intestinal, de la llengua i de la pell. Van extreure el DNA d’un total de 1076 mostres, amplificant-ne la regió V2 del gen 16S rRNA amb encebadors específics, i van procedir a una seqüenciació multiplex d’alt rendiment (High-Throughput Sequencing) amb un equip Illumina GA IIx. En van obtenir un total d’uns 58 milions de seqüències, amb una mitjana de 54.000 per mostra, que van ser analitzades contrastant amb les bases de dades per saber quins tipus bacterians i en quines proporcions.

Els resultats foren que les comunitats microbianes eren més similars entre sí en individus que viuen junts, i sobretot les de la pell, més que no les intestinals o de la llengua. Això era cert per a totes les comparacions, incloent parelles d’humans, i parelles gos-humà. Com veiem a la Figura 5, el nombre de tipus bacterians compartits és més gran entre diferents parts (front, palmells de les mans i polpes dels dits del gos) de la pell del l’humà i el seu propi gos (barres blaves), que no de l’humà amb gossos d’altres famílies (barres vermelles), o dels gossos amb persones que no en tenen (barres verdes). També veiem que el nombre de tipus bacterians compartits és molt menor en comparar mostres fecals o la llengua (Song et al 2013).

Fig 5 Song

Figura 5. Nombres de filotipus (tipus filogenètics) bacterians compartits entre adults i els seus gossos (blau), els adults amb gossos d’altres (vermell) i adults que no tenen gossos amb gossos. Es comparen (gos-humà) fronts, mans, polpes de les potes, i també mostres fecals (stool) i llengües. Significativitat de ser diferents: *p<0.05, **p<0.001 (Song et al 2013)

 

Això suggereix que els humans probablement adquireixen molts dels microorganismes en la pell per contacte directe amb el seu entorn, i que els éssers humans tendeixen a compartir més microbis amb els individus, incloent a les seves mascotes, amb els que estan en contacte freqüent. Song et al. (2013) també van descobrir que, a diferència del que passa a l’intestí, les comunitats microbianes en la pell i la llengua dels lactants i els nens eren relativament similars a les dels adults. En general, aquestes troballes suggereixen que les comunitats microbianes que es troben a l’intestí canvien amb l’edat d’una manera que difereix significativament dels que es troben a la pell i la llengua.

Encara que no és el motiu principal d’aquest post, breument es pot comentar que globalment la microbiota intestinal dels gossos no és molt diferent de la dels humans en nombres (1011 per gram) i diversitat, si bé amb més proporció de Gram-positius (aprox. 60% clostridials, 12% lactobacils, 3% bifidobacteris i 3% corinebacteris) i menys Gram-negatius (2% bacteroides, 2% proteobacteris) (García-Mazcorro & Minamoto 2013).

 

Menys asma als infants que conviuen amb gossos

I encara que no s’ha acabat de demostrat la relació amb el que hem comentat de la microbiota, darrerament s’han trobat evidències dels beneficis de tenir gos per a la salut física, i no només psíquica. Uns investigadors suecs (Fall et al 2015) han fet un estudi amb tots els nadons nascuts (1 milió) a Suècia de 2001 al 2010, comptant els que patien asma als 6 anys. Com que els suecs tenen registre de tots els gossos també des de 2001, aquests investigadors han pogut relacionar la presència de gos a casa durant el primer any del nadó amb l’aparició d’asma o no als infants, i han arribat a la conclusió que els nens tenen un risc menor d’asma (un 50% menys) si s’han criat en presència d’un gos.

Resultats semblants s’han obtingut per a nens criats en granges o en ambients rurals, i per tant amb contacte amb altres animals. Tot plegat estaria d’acord amb l’anomenada “hipòtesi de la higiene”, segons la qual la menor incidència d’infeccions als països occidentals, i sobretot als “urbanites”, seria la causa de l’augment de malalties autoimmunes i al·lèrgies (Okada et al 2010). En línia amb hipòtesi, es creu que el sistema immune humà es beneficia de la convivència amb gossos o altres animals degut al fet de compartir part de la microbiota. Tanmateix, en aquests nens suecs que convivien amb gossos i tenien menys risc d’asma es detectà un lleuger risc de malaltia pneumòccica, cosa que lliga amb la hipòtesi esmentada: més infeccions i menys al·lèrgies (Steward 2015), però amb l’avantatge de què les infeccions són més fàcils de tractar, o prevenir amb vacunes.

Fig 0 stray-dog-saves-baby

 

Bibliografia

Belkaid Y, Segre JA (2014) Dialogue between skin microbiota and immunity. Science 346, 954-959

Fall T, Lundholm C, Örtqvist AK, Fall K, Fang F, Hedhammar A et al (2015) Early exposure to dogs and farm animals and the risk of childhood asthma. JAMA Pediatrics 69, 11, e153219

García-Mazcorro JF, Minamoto Y (2013) Gastrointestinal microorganisms in cats and dogs: a brief review. Arch Med Vet 45, 111-124

Heath WR, Carbone FR (2013) The skin-resident and migratory immune system in steady state and memory: innate lymphocytes, dendritic cells and T cells. Nature Immunology 14, 978-985

Marsland BJ, Gollwitzer ES (2014) Host–microorganism interactions in lung diseases. Nature Reviews Immunology 14, 827-835

Okada H, Kuhn C, Feillet H, Bach JF (2010) The “hygiene hypothesis” for autoimmune and allergic diseases: an update. Clin Exp Immunol 160, 1-9

Song SJ, Lauber C, Costello EK, Lozupone, Humphrey G, Berg-Lyons D, et al (2013) Cohabiting family members share microbiota with one another and with their dogs. eLife 2, e00458, 1-22

Steward D (2015) Dogs, microbiomes, and asthma risk: do babies need a pet ? MD Magazine, Nov 03

Yatsunenko T, Rey FE, Manary MJ, Trehan I, Dominguez-Bello MG, Contreras M, et al. 2012. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature 486, 222–7

 

 

El panda gegant és herbívor però té una microbiota intestinal de carnívor

Click here for the english version: The giant panda is herbivore but has the gut microbiota of a carnivore

26 agost 2015

El panda gegant (Ailuropoda melanoleuca, literalment en grec “peu de gat negre i blanc”) és una de les espècies de mamífers més intrigants evolutivament. Malgrat la seva dieta exclusivament herbívora, filogenèticament és com un ós, ja que és de la família Úrsids, dins l’ordre Carnívors. La seva dieta és 99% de bambú i l’altre 1% és mel, ous, peix, taronges, plàtans, nyams i fulles d’arbusts.

Viu en algunes serralades de la Xina central, principalment a la província de Sichuan, i també a les províncies de Shaanxi i Gansu. Degut a la construcció de granges, desforestació i altres desenvolupaments, el panda ha estat foragitat de les terres baixes on havia viscut. És una espècie en perill d’extinció que necessita protecció. Hi han uns 300 en captivitat i uns 3000 en llibertat. Malgrat que els nombres estan augmentant, segueix en perill d’extinció, sobretot pel seu espai limitat (uns 20.000 km2) i l’hàbitat molt específic (boscos de bambú).

Fig0 panda bamboo

Així doncs, el panda gegant té una dieta quasi exclusiva de diferents espècies de bambú, sobretot de fulles i tiges, molt fibroses, i els brots tendres a la primavera i estiu. És per tant una dieta de poca qualitat digestiva, amb poca proteïna i molta fibra i contingut de lignina. Es passen unes 14 h al dia menjant, i poden arribar a ingerir uns 12 kg de bambú al dia.

La majoria d’herbívors tenen modificacions del tracte digestiu que ajuden a la retenció de l’aliment en procés de digestió, i contenen poblacions microbianes que els permeten utilitzar com a menja exclusiva els materials vegetals rics en polisacàrids complexos, com la cel·lulosa i hemicel·lulosa. Aquestes especialitzacions poden ser la compartimentació de l’estómac, típica dels remugants i altres no remugants (cangurs, hàmster, hipopòtams i alguns primats) o bé l’engrandiment de l’intestí gros, característic dels èquids, alguns rosegadors i els lagomorfs (conills i llebres).

En canvi, i malgrat el seu règim exclusivament herbívor, sorprenentment el panda gegant té un tracte gastrointestinal típic dels carnívors, anatòmicament similar als del gos, el gat o l’ós rentador, amb un estómac simple, té el cec degenerat i el còlon és molt curt. El tracte gastrointestinal dels pandes és unes 4 vegades la mida del cós, com altres carnívors, mentre que als herbívors és unes 10-20 vegades el cós, per tal de digerir eficientment grans quantitats de farratge. Amb això, el temps del trànsit intestinal del panda és molt curt, menys de 12 h. Tot això limita molt la capacitat de possibilitats fermentatives dels materials vegetals (Williams et al. 2013).

Per aquests motius, la digestió del bambú per al panda és molt ineficient, malgrat la seva dependència. Els pandes consumeixen l’equivalent al 6% del seu pes corporal per dia, amb una digestibilitat de la matèria seca del bambú del 20%. D’aquest, un 10% correspon a la poca proteïna que conté el bambú, i la resta és dels polisacàrids, en concret amb uns coeficients de digestió del 27% per a les hemicel·luloses i del 8% per a la cel·lulosa.

Sembla com si el panda gegant s’hagués especialitzat en el consum d’una planta amb alt contingut en fibra, sense haver modificat l’aparell digestiu, a base d’una masticació eficient, ingerint-ne grans quantitats, digerint els continguts cel·lulars enlloc de les parets cel·lulars vegetals, i excretant ràpidament els residus no digerits (Dierenfield et al. 1982).

A més a més, tenir una dependència d’un sol tipus de planta com és el bambú pot comportar mancances nutricionals segons els cicles estacionals de la planta. En aquest sentit, recentment (Nie et al. 2015) s’han estudiat les concentracions de calci, fòsfor i nitrogen de les diferents parts del bambú que mengen una població de pandes lliures. Han vist que els pandes dins del seu hàbitat fan una migració estacional en dues zones de diferent alçada al llarg de l’any i que s’alimenten de dues espècies diferents de bambú. Ambdues espècies tenen més calci a les fulles i més fòsfor i nitrogen a les tiges. Com que la variació estacional d’aparició i caiguda de fulles de les 2 espècies és diferent a causa de la diferent alçada, quan els pandes són en una de les zones mengen les fulles d’una de les espècies i les tiges de l’altre, mentre que ho fan al revés quan són a l’altra zona. O sigui, que els pandes sincronitzen les seves migracions estacionals per tal de treure’n el màxim rendiment nutricional d’ambdues especies de bambú.

Un altre inconvenient de la dependència del bambú és la seva floració. És un fenomen natural que passa cada 40-100 anys, i quan el bambú floreix, es mor, reduint la disponibilitat de menjar per als pandes. Pels anys 1970-1980 hi hagués dues floracions a gran escala a l’hàbitat dels pandes, i hi van haver més de 200 morts per aquesta raó. Tanmateix, i donat que segurament els pandes s’han trobat en la seva evolució amb moltes altres floracions massives, quan s’hi troben cerquen altres espècies de bambú o recorren llargues distàncies per cobrir les seves necessitats alimentàries (Wei et al. 2015).

En compensació, i com a adaptació a aquest menjar tant específic, el panda gegant té una sèrie de característiques morfològiques úniques, com unes fortes mandíbules i molars molt poderosos, i sobretot un pseudo-polze, com si tingués 6 dits, que és l’ós sesamoide radial engrandit, fent com un polze oposable, que li serveix per agafar millor les canyes de bambú (Figura 1).

Fig1 panda's thumb

Figura 1. El pseudo-polze del panda gegant. Imatge treta de Herron & Freeman (2014).


I cóm és que el panda va passar a ser herbívor ?

S’ha estimat que el precursor del panda gegant, omnívor com altres úrsids, va començar a menjar bambú com a mínim fa 7 milions d’anys (Ma), i va esdevenir completament dependent del bambú entre 2 i 2,4 Ma. Aquest canvi de dieta probablement va anar lligat a diverses mutacions al seu genoma, donant lloc a defectes del metabolisme de la dopamina en relació a l’apetència per la carn, i sobretot de la pseudogenització del gen Tas1r1 (Figura 2), del receptor del gust d’umami (Jin et al. 2011). L’umami és un dels 5 gustos bàsics, junt amb el dolç, salat, àcid i amarg, i ve a ser com el gust “saborós”, que normalment recorda la carn, i està relacionat amb el L-glutàmic, abundant a la carn. Aquesta mutació que feia prescindir al panda del gust umami afavorí la pèrdua d’apetit del panda per la carn i reforçà el seu estil de vida herbívor. Tanmateix, probablement altres factors addicionals devien estar implicats, ja que el gen Tas1r1 està intacte en herbívors com el cavall i la vaca (Zhao et al. 2010).

Fig2 Zhao F1 large

Figura 2. Arbre filogenètic d’alguns carnívors amb les dates per al panda gegant deduïdes dels fòssils (en blau) i de l’estudi molecular del gen TasTr1 fet per Zhao et al. (2010).


La microbiota intestinal del panda

Com era d’esperar, en fer la seqüenciació del genoma complet del panda gegant (Li et al. 2010) no s’han trobat gens específics responsables de la digestió de la cel·lulosa i hemicel·luloses. Lògicament, la possible digestió d’aquests polisacàrids complexos de les fibres del bambú aniria a càrrec dels microorganismes cel·lulolítics del tracte intestinal. Cal estudiar per tant si hi són al panda.

En estudiar les seqüències del 16S ribosomal de les microbiotes fecals dels diversos mamífers s’observa en general un augment de la diversitat bacteriana en sentit carnívors – omnívors – herbívors (Ley et al. 2008). Aquesta diversitat és menor en els pandes que als herbívors, i com veiem a la Figura 3, els pandes queden agrupats amb els carnívors (cercles vermells) malgrat ser herbívors del punt de vista de dieta.

Fig3 Ley

Figura 3. Anàlisi de components principals (PC) de les comunitats bacterianes fecals de mamífers amb diferents colors segons la dieta predominant (Ley et al. 2008)


La microbiota intestinal de la majoria dels herbívors conté sobretot bacteris anaerobis dels grups de Bacteroides, Clostridials, Fibrobacterals i Espiroquetals, que tenen les capacitats enzimàtiques per degradar els materials fibrosos vegetals i així proveeixen de nutrients als seus hostes. Al contrari, els omnívors i sobretot els carnívors tenen una microbiota predominant d’anaerobis facultatius, com les Enterobacteriaceae, a banda d’alguns Firmicutes, que inclouen Clostridials i alguns Lactobacil als, i Bacteroides.

En quant al panda gegant, els primers estudis fets amb mètodes tradicionals dependents de cultiu i anàlisi dels gens 16S rRNA amplificats (Wii et al. 2007) van identificar les Enterobacteriaceae i Streptococcus com a predominants en la microbiota intestinal. Per tant, aquest estudi suggeria que la microbiota del panda és molt semblant a la dels carnívors, com veiem en l’estudi comentat comparatiu de diversos mamífers (Ley et al. 2008), i per tant amb molt poca capacitat d’utilitzar cel·lulosa o hemicel·lulosa.

Tanmateix, un estudi posterior fet amb tècniques de seqüenciació del 16S (Zhu et al. 2011) a partir de mostres fecals de 15 pandes gegants va arribar a unes conclusions ben diferents i semblava que van trobar per primer cop proves de la digestió de cel·lulosa per la microbiota del panda gegant. En analitzar 5500 seqüències, van trobar 85 tàxons diferents, dels quals el 83% eren Firmicutes (Figura 4), i entre aquests n’hi havia 13 tàxons de Clostridium (7 d’ells exclusius dels pandes), i alguns d’aquests amb capacitat de digestió de cel·lulosa. A més, amb anàlisi metagenòmica d’alguns dels pandes van trobar alguns gens putatius per a enzims per digerir cel·lulosa, beta-glucosidasa i xilan-1,4-beta-xilosidasa per a aquests Clostridium. Tot plegat, van concloure que la microbiota del panda gegant tenia una moderada capacitat de degradació dels materials cel·lulòsics.

Fig4 Zhu 2011-Fig1C

Figura 4. Percentatges de seqüències dels principals grups bacterians trobats a les mostres fecals d’individus de panda gegant salvatges (W1-W7) i en captivitat (C1-C8) segons Zhu et al. (2011). Sota cada individu s’indica el n. de seqüències analitzades.


Però, tot just fa dos mesos s’ha publicat un treball (Xue et al. 2015) que sembla tornar enrere, concloent que la microbiota intestinal del panda gegant és molt semblant a la dels carnívors i poca cosa té d’herbívora. És un treball exhaustiu de seqüenciació massiva d’última generació del 16S rDNA amb mostres fecals de 121 pandes de diferents edats al llarg de tres estacions de l’any. Han obtingut unes 93000 seqüències, corresponents a 781 tàxons diferents.

Han trobat una predominança de Enterobacteriaceae i de Streptococcus (vermell fosc i blau fosc respectivament, Figura 5 A), i molts pocs representants dels probables cel·lulolítics com els Clostridials. A més, aquests no es veuen augmentats quan hi ha més fulles i tiges de bambú disponibles (fase T3). Aquests resultats es corresponen amb el que ja se sabia del baix nombre de gens de cel·lulases i hemicel·lulases, un 2%, fins i tot menor que al microbioma dels humans. Aquesta negligible contribució de la microbiota a la digestió de la cel·lulosa, junt amb el fet comentat que el panda és força ineficient digerint el bambú, contradiu la hipotètica importància de la digestió per part de la microbiota que s’havia suggerit pocs anys abans, com hem vist abans.

A més, en aquest treball s’ha vist molta varietat de composició de microbiota entre individus (Figura 5 B).

Fig5 Xue F1 large

Figura 5. Composició de la microbiota intestinal de 121 pandes gegants, amb (A) els gèneres dominants a totes les mostres i (B) la contribució relativa dels gèneres dominants a cada individu, agrupats per edat i temps de mostreig (Xue et al. 2015).


En aquest treball, quan han fet l’anàlisi comparativa entre la composició de la microbiota intestinal del panda gegant amb la d’altres mamífers de les diferents dietes, han confirmat que el panda s’agrupa altre cop amb els carnívors i queda ben lluny dels herbívors (Figura 6).

Fig6 Xue Fig4

Figura 6. Anàlisi de components principals de les comunitats de les microbiotes de mostres fecals de 121 pandes gegants (formes en blanc), en comparació amb les d’altres herbívors (verd), omnívors (blau) i carnívors (vermell). Les diferents formes corresponen a diferents treballs: els cercles són de Xue et al. (2015), el treball d’on s’ha tret la Figura.


Tot plegat, les característiques peculiars de la microbiota del panda gegant contribueixen al perill d’extinció que pateix. Al contrari que la majoria d’altres espècies de mamífers que han evolucionat les seves microbiotes i anatomies digestives optimitzant-les per a les seves dietes específiques, l’aberrant coevolució del panda, la seva microbiota i la seva dieta particular, és ben bé enigmàtica. Per aclarir-ho i saber com preservar aquest animal amenaçat, caldrà seguir estudiant-ho combinant metagenòmica, metatranscriptòmica, metaproteòmica i meta-metabolòmica per conèixer bé la estructura i el metabolisme de la microbiota intestinal i la seva relació amb les funcions digestives i l’estatus nutritiu del panda gegant (Xue et al. 2015).

Referències

Dierenfield ES, Hintz HF, Robertson JB, Van Soest PJ, Oftedal OT (1982) Utilization of bamboo by the giant panda. J Nutr 112, 636-641

Herron JC, Freeman S (2014) Evolutionary Analysis, 5th ed. Benjamin Cummings

Jin K, Xue C, Wu X, Qian J, Zhu Y et al. (2011) Why Does the Giant Panda Eat Bamboo? A Comparative Analysis of Appetite-Reward-Related Genes among Mammals. PLos One 6, e22602

Ley RE, Hamady M, Lozupone C, Turnbaugh PJ, Ramey RR et al. (2008) Evolution of Mammals and Their Gut Microbes. Science 320, 1647-1651

Li R, Fan W, Tian G, Zhu H, He L et 117 al. (2010) The sequence and de novo assembly of the giant panda genome. Nature 463, 311–317

Nie Y, Zhang Z, Raubenheimer D, Elser JJ, Wei W, Wei F (2015) Obligate herbivory in an ancestrally carnivorous lineage: the giant panda and bamboo from the perspective of nutritional geometry. Functional Ecology 29, 26–34

Rosen M (2015) Pandas’ gut bacteria resemble carnivores. Science News 19/05/2015

Wei G, Lu H, Zhou Z, Xie H, Wang A, Nelson K, Zhao L (2007) The microbial community in the feces of the giant panda (Ailuropoda melanoleuca) as determined by PCR-TGGE profiling and clone library analysis. Microb Ecol 54, 194–202

Wei F, Hu Y, Yan L, Nie Y, Wu Q, Zhang Z (2014) Giant Pandas Are Not an Evolutionary cul-de-sac: Evidence from Multidisciplinary Research. Mol Biol Evol 32, 4-12

Williams CL, Willard S, Kouba A, Sparks D, Holmes W et al. (2013) Dietary shifts affect the gastrointestinal microflora of the giant panda (Ailuropoda melanoleuca). J Anim Physiol Anim Nutr 97, 577-585

Xue Z, Zhang W, Wang L, Hou R, Zhang M et al. (2015) The bamboo-eating giant panda harbors a carnivore-like gut microbiota, with excessive seasonal variations. mBio 6(3), e00022-15

Zhao H, Yang JR, Xu H, Zhang J (2010) Pseudogenization of the Umami Taste Receptor Gene Tas1r1 in the Giant Panda Coincided with its Dietary Switch to Bamboo. Mol Biol Evol 27(12), 2669–2673

Zhu LF, Wu Q, Dai JY, Zhang SN, Wei FW (2011) Evidence of cellulose metabolism by the giant panda gut microbiome. Proc Natl Acad Sci USA 108, 17714–17719.

Els bacteris de la vinya i del “terroir”, i presència d’Oenococcus als raïms del Priorat

Click here for the english version: Bacteria of vineyard and terroir, and presence of Oenococcus in Priorat (South Catalonia) grapes

22 abril 2015 

Els viticultors creuen que la terra en la qual creixen les vinyes dóna una qualitat única als seus vins, i d’això en diuen el terroir, o terrer si ho traduïm al català. Es pot considerar que la resposta fisiològica de les vinyes al tipus de sòl i les condicions climàtiques, juntament amb les característiques de la varietat i la forma de cultiu, donen lloc a unes propietats organolèptiques del vi que defineixen el seu terroir (Zarraonaindia et al 2015). Ara bé, no es coneix gaire si hi podria haver una microbiota específica de cada terroir, ja que aquest tema s’ha estudiat relativament poc.

Els microorganismes vínics als raïms ? Saccharomyces no hi és o no se’l troba

Els principals protagonistes de les fermentacions víniques, la alcohòlica (Saccharomyces cerevisiae) i la malolàctica (Oenococcus oeni) normalment no apareixen fins que el most està fermentant, ja doncs al celler. En condicions normals de raïms sans, pràcticament no es troba S. cerevisiae.

Oenococcus oeni als raïms ? Em sembla que nosaltres l’hem trobat !

En quant a O. oeni, fins ara s’ha publicat molt poc sobre la seva presència i aïllament en els raïms. En diversos treballs, com Sieiro et al (1990), o més recentment Bae et al (2006), ja havien aïllat alguns bacteris làctics de la superfície de raïms, però no O. oeni. Només Garijo et al (2011) van aconseguir aïllar una colònia (una només) d’O. oeni a partir de raïms de la Rioja. D’altra banda, s’ha detectat el DNA d’O. oeni en alguna mostra de raïms de Bordeus (Renouf et al 2005, Renouf et al 2007) per PCR-DGGE del gen rpoB, encara que no van aïllar cap bacteri d’aquesta espècie.

Em plau poder comentar que recentment al nostre grup hem aconseguit aïllar O. oeni dels raïms i tipificar-ne diverses soques, i justament estem elaborant una publicació al respecte (Franquès et al 2015). Efectivament, l’equip de recerca de bacteris làctics BL-URV, junt amb els companys de llevats del mateix grup de Biotecnologia Enològica (Facultat d’Enologia de la Universitat Rovira i Virgili a Tarragona) estem treballant en un projecte europeu, el “Wildwine” (FP7-SME-2012 -315065), que té per objectius analitzar els microorganismes autòctons (d’aquí lo de “wild”) del sistema vitivinícola del Priorat, i seleccionar-ne soques amb potencial enològic. Al projecte també hi participen la DOQ Priorat i el celler Ferrer-Bobet, així com grups de recerca i associacions de cellers de Bordeus, el Piemont i Grècia. En el marc d’aquest projecte vam prendre mostres de raïms (garnatxa i carinyena) de diverses finques del Priorat (Figura 1), així com també de vins realitzant la fermentació malolàctica, i en vam obtenir uns 1900 aïllats de bacteris làctics. Vam optimitzar l’aïllament a partir dels raïms a partir de la polpa i del most amb diversos mètodes d’enriquiment, i així vam obtenir uns 110 aïllats de raïms, identificats com O. oeni per tècniques moleculars específiques. Un cop tipificats, hem comprovat que els seus perfils moleculars no coincideixen amb soques comercials i per tant són autòctones. A més, alguns d’aquests aïllats dels raïms també els hem trobat als vins fets als cellers corresponents.

Fig 1 garna-cari Priorat

Figura 1. Prenent mostres de garnatxa (esquerra) i carinyena (dreta) de finques del Priorat per tal d’aïllar bacteris làctics com Oenococcus (Fotos Albert Bordons).


La microbiota dels raïms

Els raïms tenen una ecologia microbiana complexa que inclou llevats, fongs micelials i bacteris. Alguns només es troben als raïms, com els fongs paràsits i els bacteris ambientals, i altres tenen la capacitat de sobreviure i créixer als vins: sobretot llevats, bacteris làctics i bacteris acètics. La proporció de tots plegats depèn de l’estat de maduració del raïm i de la disponibilitat de nutrients.

Quan els fruits són intactes, la microbiota predominant són els llevats basidiomicets com Cryptococcus i Rhodotorula, però quan són més madurs, comencen a tenir microfisures que faciliten la disponibilitat de nutrients i expliquen la predominança just abans de la verema d’ascomicets lleugerament fermentatius com Candida, Hanseniaspora, Metschnikowia i Pichia. Quan la pell ja està més danyada poden aparèixer llevats perjudicials com Zygosaccharomyces i Torulaspora, i bacteris acètics. Entre els fongs filamentosos poden haver-hi ocasionalment alguns molt perjudicials com Botrytis (la podridura) o Aspergillus productors d’ocratoxina, que encara que només són actius a la vinya, els seus productes poden afectar la qualitat del vi.

D’altra banda, a la superfície dels raïms s’han aïllat bacteris ubics ambientalment com diversos enterobacteris, Bacillus, i estafilococs, però cap d’ells pot créixer al vi (Barata et al 2012).

Tornant a la possible microbiota específica del terroir, s’ha vist que alguns compostos volàtils que contribueixen a l’aroma del vi, com 2-metil-butanoic o 3-metil-butanol, són produïts per microorganismes aïllats a les vinyes, com el bacteri grampositiu Paenibacillus, o el fong basidiomicet Sporobolomyces o l’ascomicet Aureobasidium. Per tant, podria haver una relació entre algunes de les espècies microbianes trobades a la vinya i alguns aromes detectats al vi, procedents del most, és clar (Verginer et al 2010).

La metagenòmica com a eina analítica de la microbiota dels raïms

Donat que els mètodes clàssics d’aïllament i cultiu dels microorganismes són lents, laboriosos i alguns dels microbis no s’aconsegueix fer-los créixer en els medis d’aïllament, actualment es recorre als mètodes de seqüenciació massiva o metagenòmica. Aquests consisteixen en analitzar el DNA present i a partir de les seqüències, deduir amb les bases de dades quins són els microorganismes presents a la mostra. En el cas dels bacteris sovint s’utilitza el DNA amplificat del fragment V4 del gen 16S RNA (Caporaso et al 2012).

S’ha utilitzat en mostres de vins botrititzats (Bokulich et al 2012) i s’han trobat proporcions de diversos bacteris làctics (però no Oenococcus), inclosos alguns no associats normalment a vi. També s’ha utilitzat per veure la microbiota resident als cellers i com canvia segons les estacions, comprovant que a les superfícies dels dipòsits i maquinària del celler hi ha una majoria de microorganismes no relacionats amb el vi ni tampoc perjudicials (Bokulich 2013).

Amb aquesta tècnica Bokulich et al (2014) també han analitzat els raïms i han vist diferències clares entre les proporcions dels diversos grups bacterians (i de fongs) entre diferents llocs, diferents varietats, i també segons les condicions ambientals o biogeogràfiques. Per exemple, en analitzar 273 mostres de mostos de raïms de Califòrnia, les 3 varietats (Cabernet, Chardonnay i Zinfandel) queden bastant discriminades en una anàlisi de components principals respecte a les comunitats bacterianes trobades a cada mostra (Figura 2).

Així doncs, els grups o taxons bacterians dominants en una varietat o ambient determinat podrien aportar unes característiques específiques en aquells vins, i això podria explicar alguns patrons regionals o de terroir en les propietats organolèptiques d’aquests vins (Bokulich et al 2014).

Fig 2 ACP Bokulich 2014

Figura 2. Anàlisi de components principals de les comunitats bacterianes de mostres de mostos de raïms de Sonoma (Califòrnia) de 3 varietats diferents (Cabernet en vermell, Chardonnay en verd i Zinfandel en blau) (Bokulich et al 2014).


Nosaltres també hem realitzat un estudi de seqüenciació massiva amb les mostres de raïms de les quals hem obtingut aïllats d’O. oeni, com he comentat abans (Franquès et al 2015), i en més 600.000 seqüències del rRNA 16S analitzades hem trobat sobretot Proteobacteris i Firmicutes. Entre aquests grampositius, hem trobat seqüències de bacteris làctics (un 15%) i d’aquests hem pogut confirmar amb èxit la presència d’O. oeni en un 5% de les seqüències. Per tant, hem aïllat O. oeni dels raïms i n’hem detectat el seu DNA en força mostres.

La microbiota bacteriana de tota la vinya i del sòl

Com veiem, s’ha estudiat una mica la microbiota dels raïms i dels vins, però molt menys la microbiota dels sòls, la qual pot definir més bé el terroir, que està influït pel clima local i les característiques de la vinya.

Veiem a la Figura 3 un resum dels principals gèneres trobats a les diferents parts de la vinya i al sòl (Gilbert et al 2014).

Fig 3 Gilbert 2014

Figura 3. Principals bacteris i fongs associats als òrgans i sòl de Vitis vinifera (Gilbert et al 2014)


Recentment s’ha publicat un treball interessant (Zarraonaindia et al 2015) sobre aquest tema, amb l’objectiu de veure si el sòl podria ser la principal font de bacteris que colonitzen els raïms. Han agafat mostres de sòl, arrels, fulles, raïms i flors de Merlot, de diferents terrenys i anys, de Suffolk, Nova York, i n’han analitzat el DNA dels bacteris presents mitjançant seqüenciació del 16S rRNA. Han trobat que un 40% de les espècies trobades són presents a totes les mostres de sòls i arrels, mentre que en fulles i fruits hi ha més variabilitat, i a més un 40% de les trobades en fulles i fruits també apareixen a les mostres de sòls. Tot plegat suggereix que molts dels bacteris s’originen al sòl.

En quant als tipus de bacteris presents, com veiem (Figura 4), predominen els Proteobacteris (sobretot Pseudomonas i Methylobacterium), principalment a les parts aèries de la planta. També hi han Firmicutes lògicament, i Acidobacteria i Bacteroides.

Fig 4 microbiota vineyard

Figura 4. Composició de la comunitat bacteriana, a nivell taxonómic de fílum, en mostres de diferents òrgans de la vinya i el seu sòl (Zarraonaindia et al 2015).


Encara que s’observen variacions en totes les mostres en funció de l’any (poden tenir diferents condicions climàtiques) i en funció de factors edàfics diferents (pH, C:N, humitat), com veiem (Figura 5) les anàlisis de components principals demostren que els tipus de mostres (sòl, arrels, fulles, raïms) es diferencien força bé, i mostres de mostos abans de fermentar queden semblants a les de raïms.

Fig 5 distribució grups mostres OTUs

Figura 5. Anàlisi de components principals mostrant les semblances en quant a la composició dels grups taxonòmics presents, entre tots els tipus de mostres, incloent-ne de mostos (Zarraonaindia et al 2015).


Això suggereix que la comunitat bacteriana present als raïms roman relativament estable fins al most, i si més no, més estable que les diferències entre òrgans. Al mateix temps, una part important dels representants dels fílums bacterians dels raïms vindrien del sòl. Això es pot explicar perquè en fer la verema manual els raïms sovint són situats en caixes que es deixen a terra, o bé si es fa verema mecànica, la maquinària utilitzada remou el terra i genera pols, que pot colonitzar els raïms.

Per tant, la microbiota del sòl és una font de bacteris associats a la vinya i pot tenir un paper en el most, i per tant en la vinificació, i potencialment en la formació de les característiques del terroir. Alguns d’aquest bacteris poden tenir papers no coneguts de productivitat o de resistència a malalties de la planta, o contribuir a les característiques organolèptiques del vi (Zarraonaindia et al 2015).

A banda d’això, i pensant en els microorganismes vínics, responsables de les fermentacions, com he comentat, al nostre laboratori hem pogut confirmar que als raïms hi ha algunes soques d’Oenococcus oeni i ho hem corroborat amb la detecció del seu DNA als mateixos raïms.


Bibliografia

Bae S, Fleet GH, Heard GM (2006) Lactic acid bacteria associated with wine grapes from several Australian vineyards. J Appl Microbiol 100, 712-727

Barata A, Malfeito-Ferreira M, Loureiro V (2012) The microbial ecology of wine grapes (Review). Int J Food Microbiol 153, 243-259

Bokulich NA, Joseph CML, Allen G, Benson AK, Mills DA (2012) Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine. Plos One 7, e36357

Bokulich NA, Ohta M, Richardson PM, Mills DA (2013) Monitoring seasonal changes in winery-resident microbiota. Plos One 8, e66437

Bokulich NA, Thorngate JH, Richardson PM, Mills DA (2014) Microbial biogeography of wine grapes is conditioned by cultivar, vintage, and climate. PNAS nov 25, E139-E148

Caporaso JG, Lauber CL, Walters WA, Berg-Lyons D, Huntley J, Fierer N, Owens SM, Betley J, Fraser L, Bauer M, Gormley N, Gilbert JA, Smith G, Knight R (2012) Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J 6, 1621–1624

Franquès J, Araque I, Portillo C, Reguant C, Bordons A (2015) Presence of autochthonous Oenococcus oeni in grapes and wines of Priorat in South Catalonia. Article en elaboració.

Garijo P, Lçopez R, Santamaría P, Ocón E, Olarte C, Sanz S, Gutiérrez AR (2011) Eur Food Res Technol 233, 359-365

Gilbert JA, van der Lelie D, Zarraonaindia I (2014) Microbial terroir for wine grapes. PNAS 111, 5-6

Renouf V, Claisse O, Lonvaud-Funel A (2005) Understanding the microbial ecosystem on the grape berry surface through numeration and identification of yeast and bacteria. Aust J Grape Wine Res 11, 316-327

Renouf V, Claisse O, Lonvaud-Funel A (2007) Inventory and monitoring of wine microbial consortia. Appl Microbiol Biotechnol 75, 149-164

Sieiro C, Cansado J, Agrelo D, Velázquez JB, Villa TG (1990) Isolation and enological characterization of malolactic bacteria from the vineyards of Northwestern Spain. Appl Environ Microbiol 56, 2936-2938

Verginer M, Leitner E, Berg G (2010) Production pf volatile metabolites by grape-associated microorganisms. J Agric Food Chem 58, 8344-8350

Tenim clostridis bons al budell i alguns eviten les al·lèrgies

 Click here for the english version: We have good clostridia in the gut and some of them prevent allergies 

1 març 2015

Clostridis: qui són ?

Els clostridis o clostridials, amb el gènere Clostridium i altres relacionats, són bacteris grampositius esporulats anaerobis estrictes, del fílum taxonòmic Firmicutes. Aquest fílum inclou a més dels clostridis, els aerobis esporulats bacil·lals (Bacillus, Listeria, Staphylococcus i altres) i els anaerobis aero-tolerants lactobacil·lals (o sigui els meus amics bacteris làctics: Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus etc). Tots els Firmicutes tenen formes regulars de coc o bacil i constitueixen la branca evolutiva de bacteris grampositius amb contingut baix de G+C al seu DNA. L’altra gran branca evolutiva de bacteris grampositius són els Actinobacteris, d’alt G+C i de formes més irregulars, que inclou Streptomyces, Corynebacterium, Bifidobacterium i Propionibacterium entre altres.

flora_cover

 

 

Com són anaerobis, els clostridis tenen un metabolisme fermentatiu, tant de carbohidrats i d’aminoàcids, essent els principals responsables de la descomposició anaeròbica de les proteïnes, coneguda com a putrefacció. Poden viure en hàbitats molt diversos, però sobretot al sòl i sobre material vegetal i animal en descomposició. Com veurem tot seguit, també formen part de la microbiota intestinal humana i d’altres vertebrats.

Els clostridis més coneguts són els dolents (Figura 1): a) C. botulinum, que produeix la botulina del botulisme, encara que avui dia té aplicacions mèdiques i cosmètiques, com sabeu (Botox); b) C. perfringens, agent de la gangrena; c) C. tetani, que causa el tètanus; i d) C. difficile, causa de diarrea postantibiòtica i algunes colitis hospitalàries.

clostridium_bacteria

Figura 1. Les 4 espècies més patògenes de Clostridium. Imatge treta de http://www.tabletsmanual.com/wiki/read/botulism

 

Clostridis a la microbiota intestinal

Tal com comentava a un post anterior (Bacteris de l’intestí ……) d’aquest mateix blog, al tracte gastrointestinal humà hi ha un ecosistema complex, i divers segons els individus i l’edat, amb un total de 1014 microorganismes. La majoria d’aquests són bacteris, a banda d’alguns arquees metanògens (un 0.1%) i algun eucariota (llevats i fongs filamentosos). Quan es fan aïllaments clàssics microbiològics a partir de mostres del colon i es cultiven els aïllats s’obtenen unes 400 espècies microbianes i els grups més assenyalats són proteobacteris (sobretot enterobacteris, com E. coli), firmicutes com Lactobacillus i alguns Clostridium, actinobacteris com Bifidobacterium, i alguns Bacteroides. Entre tots aquests aïllats s’han reconegut alguns amb efecte positiu sobre la salut i que són emprats com a probiòtics, com Bifidobacterium i Lactobacillus, bacteris considerats GRAS (Generally Recognized As Safe).

Però des de fa uns 10 anys les tècniques moleculars independents de cultiu, de seqüenciació dels gens del RNA ribosomal, han revelat moltes més espècies, arribant a ser unes 1000. Com veiem a la Figura 2, treta de la bona revisió de Rajilic-Stojanovic et al (2007), hi ha dos grups que tenen molts més representants dels que es pensava: Bacteroides i els clostridials.

 

Rajilic 2007 Fig 1

 

Figura 2. Arbre filogenètic basat en les seqüències gèniques del 16S rRNA dels diversos filotipus trobats al tracte gastrointestinal humà. La proporció de filotipus cultivables o no cultivables de cada grup està representada pel color des del blanc (cultivables) passant pel gris fins al negre (no cultivables). Per a cada grup filogenètic s’indiquen el nombre de filotipus diferents (Rajilic-Stojanovic et al 2007)

 

En estudis més recents relacionats amb la dieta com el fet per Walker et al (2011) amb mostres fecals de voluntaris s’han estimat les poblacions dels diversos grups mitjançant PCR quantitativa del DNA del 16S rRNA. Els grups més nombrosos, amb un 30% cadascun, han estat Bacteroides i els clostridials. Entre aquests destaquen Faecalibacterium prausnitzii (11%), Eubacterium rectale (7%) i Ruminococcus (6%). Com veiem el grup dels clostridials inclou nombrosos gèneres diferents del conegut Clostridium.

De fet, si considerem la població de cada espècie present al tracte gastrointestinal humà, la més abundant sembla ser un clostridial: F. prausnitzii (Duncan et al 2013).

 

Beneficis d’alguns clostridials

Aquests darrers anys s’ha anat veient que precisament són algunes espècies de clostridials, del gèneres Faecalibacterium, Eubacterium, Roseburia i Anaerostipes (Duncan et al 2013), les que més contribueixen a la producció dels àcids grassos de cadena curta (AGCC, SCFAs en anglés) al colon. Els clostridials fermenten els carbohidrats de la dieta que s’escapen de la digestió produint els AGCC, bàsicament acetat, propionat i butirat, que es detecten a la femta (50-100 mM), i que són absorbits a l’intestí. L’acetat és metabolitzat sobretot pels teixits perifèrics, el propionat és gluconeogènic, i el butirat és la principal font d’energia de l’epiteli del colon. Els AGCC en total arriben a ser el 10% de l’energia obtinguda per l’hoste humà. Alguns d’aquests clostridials com Eubacterium i Anaerostipes també utilitzen com a substrat el lactat produït per altres bacteris com els làctics i Bifidobacterium, per produir igualment els AGCC (Tiihonen et al 2010).

 

Els clostridis de la microbiota protegeixen de la sensibilització per al·lèrgens dels aliments

Efectivament, això és el que han demostrat Stefka et al (2014) en un recent treball excel·lent, com a darrera troballa dels aspectes positius dels clostridis de la microbiota. En administrar al·lèrgens (Ara h) del cacauet (Arachis hypogaea) a ratolins que havien estat tractats amb antibiòtics o a ratolins sense microbiota (Germ-free, criats en ambient estèril), observaven que hi havia una hiperreactivitat al·lèrgica sistèmica, amb inducció de immunoglobulines específiques, o sigui, una sensibilització.

En els ratolins tractats amb antibiòtics s’observava una reducció significativa de la microbiota en el nombre de bacteris (analitzant els gens del 16S rRNA) a l’íleon i a la femta, i a més s’alterava la biodiversitat, de tal manera que els Bacteroides i clostridials predominants en condicions normals quasi desapareixien i en canvi augmentaven només els lactobacils.

Per veure el paper d’aquests grups predominants a la microbiota, Stefka et al. van colonitzar l’intestí de ratolins sense microbiota amb Bacteroides, i altres amb clostridis. Això és el que se’n diuen animals gnotobiòtics, o sigui animals dels que se sap exactament quins tipus de microorganismes contenen.

Doncs bé, Stefka et al. han demostrat que la colonització selectiva de ratolins gnotobiòtics amb clostridis els confereix una protecció enfront els al·lèrgens del cacauet, cosa que no passa amb Bacteroides. Per a la colonització amb clostridis, van utilitzar una suspensió d’espores extretes de mostres fecals de ratolins sans, i van confirmar que les seqüències gèniques d’aquest extracte corresponien sobretot a membres dels clostridials.

Així doncs, en efecte, els ratolins colonitzats amb clostridis presentaven menors nivells de l’al·lergen al sèrum (Figura 3), tenien menor contingut d’immunoglobulines, no hi havia inflamació del cec, i la temperatura corporal es mantenia. Els ratolins tractats amb antibiòtics que havien presentat la reacció hiperal·lèrgica en administrar-los els antígens també reduïen la reacció en colonitzar-los amb els clostridis.

 

fig 4 skefta

Figura 3. Nivells de l’al·lergen “Ara h” del cacauet en sèrum després de la ingesta de cacauets, en ratolins sense microbiota (Germ-free), colonitzats amb Bacteroides (B. uniformis) i colonitzats amb clostridis (Clostridia). Tret de Stefka et al (2014).

 

A més, en aquest treball exhaustiu, Stefka et al. han realitzat una anàlisi transcriptòmica amb microarrays de les cèl·lules de l’epiteli intestinal dels ratolins i han trobat que els gens de producció de la citoquina IL-22 estan induïts als animals colonitzats amb clostridis, i que aquesta citoquina redueix la captació de l’al·lergen per part de l’epiteli i per tant n’evita l’entrada a la circulació sistèmica, contribuint també a la protecció enfront la hipersensibilització. Tots aquests mecanismes han estat revisats per Cao et al (2014) i en veiem un esquema a la Figura 4.

En conclusió, amb això s’obren noves perspectives d’estudis per prevenir les al·lèrgies alimentàries mitjançant la modulació de la composició de la microbiota intestinal. Tot plegat, afegint aquestes qualitats antiinflamatòries a més de les esmentades de producció de butirat i altres AGCC, i del consum de lactat, caldrà anar pensant en la possible utilització de clostridials per a candidats com a probiòtics, a banda dels reconeguts Lactobacillus i Bifidobacterium.

 

fig 4 Cao b

 

Figura 4. Esquema de la inducció dels clostridis sobre la producció de citoquines per les cèl·lules epitelials de l’intestí, així com la producció d’àcids grassos de cadena curta (SCFAs) pels clostridis (Cao et al 2014).

 

Bibliografia

Cao S, Feehley TJ, Nagler CR (2014) The role of commensal bacteria in the regulation of sensitization to food allergens. FEBS Lett 588, 4258-4266

Duncan SH, Flint HJ (2013) Probiotics and prebiotics and health in ageing populations. Maturitas 75, 44-50

Rajilic-Stojanovic M, Smidt H, de Vos WM (2007) Diversity of the human gastrointestinal tract microbiota revisited. Environ Microbiol 9, 2125-2136

Rosen M (2014) Gut bacteria may prevent food allergies. Science News 186, 7, 4 oct 2014

Russell SL, et al. (2012) Early life antibiotic-driven changes in microbiota enhance 
susceptibility to allergic asthma. EMBO Rep 13(5):440–447

Stefka AT et al (2014) Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Nat Acad Sci 111, 13145-13150

Tiihonen K, Ouwehand AC, Rautonen N (2010) Human intestinal microbiota and healthy aging. Ageing Research Reviews 9:107–16

Walker AW et al (2011) Dominant and diet-responsive groups of bacteria within the human colonic microbiota. The ISME J 5, 220-230

Sorprenent: bacteris de l’acne humana a la vinya !!

Click here for the english version: Surprising: bacteria of human acne passed to the vineyard !! 

Realment sorprenent, però això sembla: uns investigadors italians i austríacs han publicat un treball (Campisano et al. 2014) on demostren que bacteris de l’espècie Propionibacterium acnes, relacionada amb l’acne humana, es troben com a endòfits obligats als teixits de l’escorça de Vitis vinifera, la vinya.

Alguns bacteris patògens dels humans, com Salmonella, són capaços de colonitzar teixits vegetals però de forma oportunista i temporalment (Tyler & Triplett 2008). De fet, hi ha un benefici mutu temporal entre plantes i bacteris, de manera que alguns d’aquests enterobacteris no patògens per a les plantes hi viuen endofíticament i poden ser beneficioses per a elles. Aquests patògens per als humans, en el seu cicle biològic utilitzen les plantes com a hostes alternatius per sobreviure al medi ambient, passant-hi mitjançant aigües de regadiu contaminades. Per tant, alguns bacteris sovint són hostes endòfits temporals de les plantes.

Però d’altra banda, són relativament rars els casos de bacteris que canviïn d’hoste i acabin adaptant-se al nou hoste, essent finalment endòfits fixos. Aquesta transferència horitzontal passa sobretot entre hostes propers evolutivament, com bacteris simbiòtics d’insectes àfids que s’ha demostrat que han passat a altres espècies d’àfids (Russell & Moran 2005). També s’ha suggerit la transferència horitzontal en bacteris làctics beneficiosos del tracte intestinal de vertebrats com Lactobacillus reuteri, del qual es troben soques semblants en diverses espècies de mamífers i aus.

Doncs bé, anant més enllà, en el treball de Campisano et al. objecte d’aquest comentari, es conclou que un tipus d’aquests bacteris relacionats amb l’acne humana haurien passat a la vinya, o sigui, els bacteris haurien fet una transferència horitzontal interregne, des d’animals mamífers a plantes.

 

Propionibacterium acnes tipus Zappae

L’acne, com sabeu, és una afecció humana consistent en un excès de secreció de les glàndules pilosebàcies de la pell causada per canvis hormonals, sobretot als adolescents. Les glàndules s’acaben inflamant, obstruint-se els porus i apareixent erupcions cutànies. El microorganisme associat a aquestes infeccions és el bacteri oportunista comensal P. acnes, bacil grampositiu anaeròbic aerotolerant, que s’alimenta dels àcids grassos del sèu produït per les glàndules.

fig1 Akne-jugend

Jove amb acne (Wikimedia, públic)

fig2

Propionibacterium acnes al microscopi electrònic de rastreig (esquerra) i tenyit amb cristall violeta (dreta). Tret de Abate ME (2013) Student Pulse 5, 9, 1-4.

 

Curiosament, altres espècies del mateix gènere Propionibacterium molt conegudes en biotecnologia microbiana industrial són les utilitzades per a la producció d’àcid propiònic, vitamina B12, i els formatges suïssos tipus Emmental o Gruyère.

Campisano et al. han fet un estudi de l’endomicrobioma de la vinya mitjançant la tècnica de seqüenciació (Roche 454) amplificant la regió hipervariable V5-V9 dels rDNA 16S bacterians presents als teixits vegetals de la planta. En 54 de les 60 plantes analitzades, entre un 0,5% i un 5% de les seqüències trobades corresponen a bacteris de l’espècie Propionibacterium acnes. Això ho han confirmat per observacions d’hibridació fluorescent in situ (FISH) amb fluorcroms i sondes específiques de P. acnes.

fig 3 FISH P acnes escorça vinya

Localització de P. acnes (taques blavoses fluorescents) a l’escorça d’una tija de vinya mitjançant microscòpia FISH amb sondes específiques d’aquest bacteri (Campisano et al 2004).

 

Els autors d’aquest treball proposen per a aquest bacteri trobat el nom de P. acnes Zappae, recordant l’excèntric músic i compositor Frak Zappa, per subratllar l’inesperat i gens convencional hàbitat d’aquest tipus de P. acnes.

 

fig 4 Frank Zappa

Frank Zappa (1940-1993), l’excèntric i satíric cantant, guitarrista i compositor. Foto: Frank Zappa reviews.

 

 

I cóm va passar aquest bacteri d’origen humà a la vinya ?

Per resoldre aquest enigma, Campisano et al. han agafat les seqüències 16S rDNA i d’altres gens (recA i tly), dels P. acnes Zappae que han trobat i les han comparat amb les dels P. acnes d’origen humà de les bases de dades. Comparant les filogènies i els clusters que es dedueixen, han arribat a concloure que P. a. Zappae s’ha diversificat evolutivament dels altres molt recentment. Estudiant-ne en detall les seqüències del gen recA de P. a. Zappae, i tenint en compte la seva taxa de mutació probable i el seu temps de generació (unes 5 h), dedueixen que la diversificació respecte als altres P. acnes es va produir fa uns 6000-7000 anys.

Aquesta data coincideix amb la domesticació coneguda de la vinya pels humans, que es creu que va tenir lloc fa uns 7000 anys a la regió meridional del Caucas, entre el mar Negre i el Caspi, entre les actuals Turquia, Georgia, Armenia i Iran (Berkowitz 1996). La vinya té l’origen en una subespècie silvestre de Vitis que va sobreviure l’Era glacial i va ser domesticada. De la planta originària en sortiren tres subespècies, i una d’elles, Vitis vinifera pontica,a la zona esmentada i més al sud a Mesopotàmia s’acabaria escampant per Europa gràcies alsfenicis.

Per tant, la conclusió és que P. a. Zappae es va originar a partir del P. acnes humà fa uns 7000 anys, pel contacte de les mans humanes amb els raïms i altres parts de la vinya en veremar-la i traginar-la. Tal com diuen els autors, aquest cas seria la primera evidència de transferència horitzontal interregne, des dels humans a les plantes, d’un bacteri simbiont obligat. A més, això fa més remarcable l’extrema adaptabilitat dels bacteris i que llur capacitat d’explotar nous hàbitats pot tenir impactes imprevistos en l’evolució de la relació hoste-simbiont o fins i tot hoste-patogen.

fig 5 m_so_america_hands_close

 Veremant a mà a Xile (Fine Wine and Good Spirits)

 

 

Bibliografia

Berkowitz M (1996) World’s earliest wine. Archaeology 49, 5, sept/oct.

Campisano Aet al. (2014) Interkingdom transfer of the acne-causing agent, Propionibacterium acnes, from human to grapevine. Mol Biol Evol 31, 1059-1065.

Gruber K (4 march 2014) How grapevines got acne bacteria. Nature News 4 march 2014.

Russell JA, NA Moran (2005) Horizontal transfer of bacterial symbionts: heritability and fitness effects in a novel aphid host. Appl Environ Microbiol 71, 7987-7994.

Tyler HL, EW Triplett (2008) Plants as a habitat for beneficial and/or human pathogenic bacteria. Ann Rev Phytopathol 46, 53-73.

Wikipedia, per descomptat: Propionibacterium acnes, Vitis, …

Walter J, RA Britton, S Roos (2011) PNAS 108, 4645-4652.

Mycobacterium tuberculosis, el bacteri patògen que ens acompanya des què vam sortir d’Àfrica

Click here for the english version: Mycobacterium tuberculosis, the pathogen bacterium that is with us since we left Africa

La tuberculosi i els causants

La tuberculosi és una malaltia infecciosa comuna i sovint mortal si no és tractada, causada per micobacteris, principalment Mycobacterium tuberculosis. Els micobacteris com M. tuberculosis i M. leprae (el de la lepra) són considerats gram-positius perquè tenen glicopèptid, però no es tenyeixen amb el cristall violeta, perquè per fora del glicopèptid tenen una bona capa de lípids, de l’anomenat àcid micòlic (Figura 1). Precisament el prefix “mico”  o “myco” del nom prové de l’apariència de fong de la superfície dels cultius líquids d’aquests micobacteris.

fig 1 NIH NatInstAllergy and Infect Diseases 1st line tractament TB

Figura 1. Mycobacterium tuberculosis amb la seva particular paret cel.lular, i els antibiòtics més usats per combatre’l (Figura treta de National Institute of Allergy and Infectious Diseases)

Aquest micobacteri fou descobert com a causant de la tuberculosi per l’alemany Robert Koch (1882) i per això també se l’anomena bacil de Koch. És un bacteri aerobi estricte, li calen alts nivells d’oxigen, i per això infecta sobretot els pulmons. Té un temps de generació d’unes 15-20 hores, o sigui, un creixement molt lent en comparació amb altres bacteris (recordeu els 20 minuts d’Escherichia coli). Des del punt de vista taxonòmic, són actinobacteris, o sigui gram-positius d’alt G+C, com els corinebacteris o els actinomicetals.

La virulència de M. tuberculosis és molt complexa i amb moltes facetes (Todar K.). Encara que aparentment no produeix cap toxina, té un gran repertori de propietats estructurals i fisiològiques que expliquen la seva virulència i la patologia de la tuberculosi. Un cop als pulmons, el bacteri és captat pels macròfags alveolars, però aquests no poden digerir-lo per l’estructura de la seva paret cel·lular i perquè els bacteris neutralitzen els compostos reactius del macròfag. L’àcid micòlic el fa impermeable també al lisozim. M. tuberculosis creix intracel·lularment sense ser afectat pel sistema immunitari, i al mateix temps, secreta diverses proteïnes implicades en la patogènesi. Cal destacar-ne el complex antigen 85, que lliga la fibronectina, que facilita la formació dels tubercles als pulmons (Figura 2).

fig 2 humanorgans.org:tuberculosis

Figura 2. Progrès de la infecció per M. tuberculosis als pulmons, amb la formacio de tubercles (Tret de humanorgans.org/tuberculosis)

La tuberculosi sol atacar els pulmons, però també pot afectar molts altres òrgans. Els símptomes clàssics de la tuberculosi són una tos crònica, amb esput sanguinolent, febre i altres símptomes. El diagnòstic es basa en la radiologia del tòrax, una prova de la tuberculina cutània i anàlisis de sang, així com un examen al microscopi i un cultiu microbiològic dels fluids corporals. El tractament de la tuberculosi és complicat i requereix llargs tractaments amb diversos antibiòtics. Els més utilitzats habitualment són la rifampicina i la isoniazida (Figura 1). Malgrat això, la resistència als antibiòtics és un problema creixent en alguns tipus de tuberculosi. La prevenció es basa sobretot en la vacunació, generalment amb la vacuna Bacillus Calmette-Guérin (BCG).

La tuberculosi s’encomana per via aèria, quan les persones infectades tussen, esternuden o escupen. Un terç de la població actual del món està infectada amb M. tuberculosis, i cada segon és infectada una nova persona. Tanmateix, en la majoria d’aquests casos la malaltia no es desenvoluparà completament, ja que les infeccions asimptomàtiques i latents són les més habituals. Aproximadament una de cada deu infeccions latents progressarà finalment a la malaltia activa, que, si no és tractada, mata més de la meitat de les víctimes. En un any (2004), les estadístiques mundials incloïen 14,6 milions de casos actius crònics, 8,9 milions de casos nous, i 1,6 milions de morts, majoritàriament en països en desenvolupament. A més, un nombre creixent de persones del món desenvolupat estan contraient la tuberculosi perquè el seu sistema immunitari es veu compromès per medicaments immunosupressors, abús de drogues o la sida.

Quan va ser l’origen de la tuberculosi humana ?

L’origen de les malalties infeccioses poblacionals (com la peste, el còlera, etc), o sigui les que s’escampen fàcilment on hi ha força humans junts, s’ha associat a la transició demogràfica neolítica, de fa uns 10.000 anys, quan la revolució de l’agricultura permetè l’establiment dels primers nuclis sedentaris, amb força humans vivint junts. Moltes d’aquests malalties van associades a altres animals, dels quals passen als humans. Fins fa poc es creia que la tuberculosi era una d’aquest tipus, havent-se originat també al Neolític, però de fet la majoria de tuberculosis no tenen una relació amb altres animals.

Tanmateix, un estudi recent (Comas et al. 2013) aporta dades en el sentit que aquesta malaltia s’originà força abans, fa més de 70.000 anys, acompanyant els humans moderns sortint d’Àfrica i escampant-se pel món. Efectivament, aquest treball de 22 coautors de 9 països (i dels quals el primer autor és el jove valencià Iñaki Comas) analitza i compara els genomes de 259 soques del complex M. tuberculosis per tal de veure la seva història evolutiva. En fer-ho, dins del genoma de 4,4 Mb d’aquesta espècie identifiquen 34.167 llocs polimòrfics SNPs, o sigui, llocs del DNA que tenen algun nucleòtid diferent segons les soques, amb els quals han pogut reconstruir la filogènia d’aquest bacteri. En fer-ho, es confirmen 7 llinatges (agrupacions de soques) que s’havien insinuat per altres tècniques. El més interessant es que aquesta filogènia dels genomes de M. tuberculosis és calcada de la filogènia dels genomes mitocondrials humans, com veiem a la Figura 3. Per tant, això suggereix que l’evolució dels bacteris de la tuberculosi va en paral·lel a la dels humans moderns.

fig 3

Figura 3. La filogènia dels genomes de 220 soques de M. tuberculosis amb els diferents llinatges (MTBC, esquerra) és calcada a la dels genomes mitocondrials (dreta) de 4995 humans amb els seus principals haplogrups (tret de Comas et al. 2013, Fig. 1 c, d).

En base a aquestes filogènies i a les freqüències de mutacions que s’observen als genomes de M. tuberculosis s’ha pogut establir l’origen dels diferents llinatges del bacteri, calculant en quin moment del paleolític humà van anar apareixent les diferents branques, des d’aprox. 73.000 fins 42.000 anys (Figura 4), que, com és lògic havent vist el paral·lelisme amb el DNA mitocondrial, coincideixen amb les dates proposades de l’expansió dels humans moderns des d’Àfrica cap a Euràsia.

fig 4

Figura 4. Expansió del complex M. tuberculosis sortint d’Àfrica, amb l’origen dels diferents llinatges, amb les dates aproximades (milers d’anys) de les ramificacions (tret de Comas et al. 2013, Fig. 2a).

Per tant, es pot concloure que la tuberculosi i el seu agent bacterià han estat un company constant dels humans moderns durant l’evolució d’aquests i la seva disseminació global, com a mínim en els darrers 70.000 anys, i a més el bacteri M. tuberculosis ha estat capaç d’adaptar-se als canvis de població humans. A més, en aquest sentit aquests darrers anys s’està observant un augment de soques amb resistència múltiple als antibiòtics. L’estudi d’aquests mecanismes d’adaptació del bacteri poden ajudar a predir futurs patrons de la malaltia i dissenyar estratègies racionals per combatre’l.

Bibliografia

Comas, Iñaki, et al. (2013) Out-of-Africa migration and Neolithic coexpansion of Mycobacterium tuberculosis with modern humans. Nature Genetics 45, 1176-1182.

Tuberculosi a la viquipèdia: http://ca.wikipedia.org/wiki/Tuberculosi.

Mycobacterium tuberculosis a la wikipedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium_tuberculosis

Todar K., Todar’s Online Textbook of Bacteriology.

No hi ha tanta porqueria al “DNA brossa”: el projecte ENCODE

Encara que ja fa un parell de mesos (6 de setembre) que va sortir la notícia, ara m’he entretingut a mirar una mica més el projecte ENCODE (Encyclopedia Of DNA Elements). Tal com comentava la meva ex-alumna i amiga Andrea al blog de l’Associació de Biotecnòlegs de Catalunya en el seu article “Palabras y ADN”, fou una notícia força esbombada aquells dies als mitjans de comunicació, en el sentit que s’havia descobert que l’anomenat fins ara “DNA brossa” contenia molta informació útil i important, un tresor segons alguns mitjans. Bé doncs, anem a veure què és aquest tresor amagat, o més ben dit, quina és la rellevància d’aquest treball.

La paradoxa de la discordància entre nombre de gens i complexitat

Força abans de disposar dels genomes seqüenciats s’havia fet evident que la quantitat de DNA d’un organisme, i sobretot el nombre de gens, no es correspon amb la seva complexitat. Així, la quantitat de DNA del genoma d’un humà és aproximadament de 3.200 Mb (Mb o megabases, o sigui milions de parells de bases, ja sabeu, de les 4 possibles: A, T, G, C), i aquest DNA humà conté uns 23.000 gens, o sigui, les unitats que codifiquen per a alguna proteïna. Els altres mamífers tenen una quantitat semblant de DNA i de nombre de gens. En canvi, un cuc com Caenorhabditis (un nemàtode d`1 mm de llarg molt utilitzat als laboratoris com a animal model) té un DNA total de 100 Mb, però que conté informació per a 19.000 gens. O sigui, que el nostre nombre de gens és semblant al d’un ratolí, i només un 20% més gran que el d’un cuc. La comparació serviria igual respecte a insectes o plantes, i en alguns casos fins i tot tenen més gens que els humans, com la planta Arabidopsis amb uns 32.000 gens.

O sigui, està clar que la indubtable complexitat dels humans i els mamífers en general, respecte els invertebrats com els cucs, o respecte les plantes, no és deguda a la utilització d’un major nombre de gens. Cal entendre com el mateix nombre de gens és capaç de produir aquesta complexitat.

Aquests 23.000 gens dels humans que codifiquen per a proteïnes (transcrivint el DNA gènic a RNA missatger i traduint aquests a proteïnes als ribosomes) només suposen com a molt uns 150 Mb, o sigui, un 5% dels 3.000 Mb de DNA total. O sigui, que el 95% del genoma humà no codifica per a proteïnes. D’aquí va venir la suposició, ja des dels anys 1970, que tot aquest DNA aparentment no servia per a res, era “DNA brossa” (junk DNA).

De fet aquest terme de brossa ha estat utilitzat en sentit divulgatiu pels mitjans no especialitzats, ja que més correctament els científics sempre l’han anomenat DNA de funció desconeguda o DNA no-codificant, perquè està clar que alguna funció ha de tenir, i més tenint en compte aquesta complexitat dels organismes que tenen més DNA. Les seqüències de DNA no-codificant ja fa temps que se sap que són de diversos tipus, simplificant:

  • RNAs no codificants (que no es tradueixen a proteïnes), com els ribosomals, de transferència, microRNA i altres.
  • Elements reguladors que controlen la transcripció dels gens a RNA.
  • Introns, seccions no codificants internes del gen que són eliminats del RNA missatger.
  • Pseudogens, seqüències relacionades amb gens coneguts que han perdut evolutivament la seva funció.
  • Elements gènics mòbils, els transposons i retrotransposons, dels quals n’hi ha múltiples còpies per tot el genoma. Alguns dels retrotransposons estan relacionats amb elements virals.
  • Telòmers, les regions de DNA repetitiu a les regions finals dels cromosomes, que eviten el deteriorament d’aquests durant la replicació del DNA.

Com veiem, part d’aquest DNA no-codificant ja se sap que té una funció, però per a una gran part encara no està clar el seu paper.

Després del projecte del genoma humà, el projecte ENCODE

Com recordareu, el 2001 fou publicat a Nature (15 feb 2001) el primer esborrany del genoma humà per part del Consorci Internacional, i el 2003 en fou publicat el genoma complet. Aquest codifica el disseny bàsic, però la funció de la majoria dels 3.000 milions de bases segueix sent desconeguda. Un cop feta aquesta tasca del genoma, ja era evident que caldria també adquirir un coneixement enciclopèdic sobre l’organització de la cromatina (Figura 1), o sigui, el DNA enrotllat i replegat juntament amb proteïnes, les histones sobretot, per entendre com funciona i es regula l’expressió dels gens.

Amb aquest objectiu, que va lligat al mateix temps a entendre quines funcions té tot el DNA que no codifica per a proteïnes, va néixer el projecte ENCODE.

 Més enllà de la seqüènciaFigura 1. Més enllà de la seqüència (Ecker at al. 2012)

 

Així doncs, el projecte ENCODE té com a objectiu final aconseguir descriure com la informació dels gens humans es regula i s’expressa en elements funcionals, per tal d’orquestrar el desenvolupament i funcions d’un ser humà. Així, aquest projecte serà una eina poderosa més per lluitar millor contra les malalties.

En concret, el projecte conté dades del grau de metilació del DNA i de modificacions químiques de les histones que poden influir en la taxa de transcripció del DNA a molècules de RNA. També s’hi estudien les interaccions de gran abast de la cromatina, com els bucles, que alteren les proximitats relatives de diferents regions cromosòmiques en 3 dimensions i també afecten la transcripció..A més a més, el projecte descriu l’activitat d’unió al DNA dels factors de transcripció i la localització i seqüència dels elements de DNA reguladors gènics, que inclou les regions promotores properes als gens, però també elements reguladors més distants.

Una altra secció del projecte està dedicada a comprovar l’accessibilitat del genoma a l’acció de les proteïnes DNAsa I. Aquestes regions, anomenades llocs hipersensibles a DNAsa I, serveixen per indicar les seqüències específiques on la unió de factors de transcripció i altres proteïnes reguladores han causat desplaçaments dels nucleosomes (les “perles” d’histones al voltant dels quals està enrotllat el DNA). El projecte ENCODE també cataloga les seqüències i quantitats dels RNA transcrits, tant de les regions codificants com de les no-codificants.

logo EncodeFigura 2. Logo del projecte ENCODE

El consorci del projecte ENCODE

ENCODE és l’acrònim de ENCyclopedia Of DNA Elements, i el consorci públic de recerca que hi treballa fou impulsat pel National Human Genome Research Institute (NHGRI), depenent del NIH dels USA. El NHGRI fou el que impulsà el projecte del Genoma Humà. El projecte començà amb un Projecte Pilot el 2003, i vistos els bons resultats d’aquest gràcies sobretot al desenvolupament de noves tecnologies (per ex. piroseqüenciació) que generen una gran quantitat de dades dels elements funcionals, el 2007 s’augmentà l’escala del projecte ENCODE mitjançant nous finançaments del NHGRI. La inversió total es calcula en uns 185 milions de US$.

En el projecte ha tingut un paper clau la col·laboració entre diferents grups de recerca i la seva coordinació. Hi han participat 32 instituts de recerca de tot el món, si bé la majoria dels USA, amb alguns grups britànics, xinesos, alemanys i dos grups espanyols: el del Dr Roderic Guigó del Centre de Regulació Genòmica de Barcelona, i el Centre Nacional d’Investigació Oncològica de Madrid. Un total de 442 investigadors de tots aquests centres han realitzat un total de 1649 experiments, força d’ells de caràcter bioinformàtic, i durant 5 anys de feina (2007-2012) s’han acumulat 15000 GBytes d’informació en 12000 fitxers analitzats. L’anàlisi de les dades ha estat coordinat pel European Bioinformatics Institute del European Molecular Biology Laboratory, a Hinxton, Regne Unit.

Tots els resultats, un cop analitzats, han estat publicats en les bases de dades d’accès lliure a internet. Les publicacions principals del consorci han estat 30, de les quals 6 articles a Nature (6 septembre 2012), més 18 a Genome Research i 6 a Genome Biology, a banda de moltes altres més específiques (unes 80 fins ara) publicades per altres grups treballant amb les dades obtingudes al projecte.

Nature Encode coverFigure 3. Portada de la revista Nature amb l’anunci del projecte ENCODE, 6 setembre 2012

Mètodes utilitzats a l’ENCODE

El consorci ENCODE ha estudiat les dades corresponents a 1640 genomes, i per a 147 línies cel·lulars diferents. Des del 2007 els mètodes desenvolupats han permès realitzar un nombre ingent d’estudis de seqüenciació per mapejar elements funcionals d’una part del genoma humà, entenent com element funcional a qualsevol fragment genòmic que codifica un producte definit (per ex. una proteïna o un RNA no codificant) o té un paper reproduïble (per ex. la unió d’una proteïna o una estructura específica de la cromatina).

Els elements mapejats i els mètodes corresponents inclouen:

-Regions que transcriuen RNA, que es detecten per diferents tècniques: RNA-seq (o sigui seqüenciació d’alt rendiment dels cDNA obtinguts de RNA total), CAGE (Cap Analysis Gene Expression, o sigui l’anàlisi de les puntes 5’ dels RNAm transcrits mitjançant seqüenciació dels seus cDNA), RNA-PET (Paired-End-Tag, o sigui un mètode de seqüenciació per als mRNA transcrits sencers, ja que captura les dues puntes 5’ i 3’ i aconsegueix els millors resultats d’anotació de gens), i anotació manual de les seqüències.

-Regions que codifiquen proteïnes, detectades per espectrometria de mases.

-Llocs d’unió de factors de transcripció, detectats per ChIP-seq (que combina immunoprecipitació de cromatina, ChIP, amb la seqüenciació massiva en paral·lel de DNA, per identificar els llocs d’unió de les proteïnes associades al DNA), i per DNAsa-seq (que seqüencia les regions susceptibles de ser tallades per DNAses.

-Estructura de la cromatina, analitzada per DNAsa-seq, FAIRE-seq (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatorry Elements, mètode més sensible que la DNAsa-seq, sobretot per detectar elements reguladors distals), ChIP-seq de les histones, i MNasa-seq (seqüenciació d’àcids nucleics d’una sola cadena tallats amb MNasa, una nucleasa micrococal de Staphylococcus).

-Llocs de metilació del DNA, amb l’assaig RRBS (Reduced Representation Bisulphite Sequencing), que els detecta pel tractament amb bisulfit que converteix les citosines no metilades en uracil.

-Interaccions entre elements genètics. El superenrrotllament del DNA a la cromatina i l’empaquetament dels diversos cromosomes dins del nucli fan que hi hagi interaccions entre diversos elements genètics que influeixen en l’expressió. Per detectar-les s’utilitza el mètode 5C (Chromosome Conformation Capture Carbon Copy), que combina l’entrecreuament d’elements genètics, sintetitzant una biblioteca de fragments de DNA que interactuen, i identificant-los seqüenciació d’alt rendiment.

Finalment, per comparar i integrar els resultats dels diferents laboratoris, en la producció de dades es prioritzaren dos conjunts de línies cel·lulars, anomenats nivells (tier) 1 i 2. Les de nivell 1 d’alta prioritat eren línies molt estudiades: d’eritroleucèmia, cèl·lules mare embrionàries H1, i els B-limfoblastoids. Aquesta darrera també és una de les línies cel·lulars que forma part del projecte 1000 Genomes, que tot just ara se n’han publicat els resultats al Nature. Les línies cel·lulars del nivell (tier) 2 inclouen les del carcinoma cervical HeLa-S3, unes d’hepatoblastoma, i cèl·lules d’endoteli venós umbilical. Per tal de tenir un ample espectre de diversitat biològica del cos humà, els assajos també foren realitzats en la resta de línies cel·lulars fins a 147, agrupades en un nivell 3.

mètodes EncodeFigura 4. Esquema de diverses metodologies utilitzades al projecte ENCODE. Crèdits: Darryl Leja (NHGRI, Bethesda, MD, USA), Ian Dunham (European Bioinformatics Institute, Cambridge).

Manual del genomaFigura 5. Esquema global de les metodologies del projecte ENCODE (Maher, 2012), definit aquí com el “Manual del Genoma”.

Resultats principals

El mapejat sistemàtic al DNA humà de regions transcrites, de llocs d’unió de factors de transcripció, de l’estructura de la cromatina i de les modificacions de les histones dut a terme pel projecte ENCODE han permés assignar funcions bioquímiques a un 80% del genoma, i particularment a fora de les regions codificants per a proteïnes, acabant de descartar la visió que el genoma humà era sobretot DNA brossa. Es demostra que els espais entre els gens estan plens d’elements reguladors i nombroses regions que codifiquen RNAs que no es tradueixen en proteïnes però poden tenir funcions de regulació. Han trobat 400.000 reguladors de gens que augmenten o inhibeixen la seva expressió i 70.000 reguladors que activen altres gens. Tot plegat aporta noves perspectives als mecanismes de regulació gènica.

Els elements nous identificats també mostren una correspondència estadística amb seqüències variants lligades a malalties humanes, i per tant poden facilitar la interpretació d’aquestes variants. En fer estudis de les variants de seqüències genètiques associades amb algunes malalties en diferents individus (estudis GWAS, Genome-Wide Association Study), s’ha vist que els SNPs (single nucleotide polymorphisms, polimorfismes d’un sol nucleòtid) associats amb malalties són majoritaris als elements no codificants per a proteïnes. En molts casos, els fenotips de la malaltia poden ser associats amb un tipus cel·lular específic o un factor de transcripció.

En conjunt, el projecte aporta noves perspectives en l’organització i regulació dels nostres gens i genoma, i és un recurs expansiu d’anotacions funcionals per a la recerca biomèdica. Tanmateix, tot això només és el començament, tal com veiem a la Figura 5, ja que queden molts altres tipus cel·lulars per analitzar, a banda de desxifrar totes les interaccions trobades i desvetllar-ne el seu significat. El principal valor dels recursos del ENCODE no són les publicacions ara presentades, sinó la utilització de les dades per molts científics en els propers temps.

proteïna - DNA

Figura 6. Una proteïna acoblada al DNA (foto de Tom Ellenberger, Washington University School of Medicine in St. Louis, USA).

Bibliografia

PUBLICACIONS DEL ENCODE al Nature, 6 sept. 2012:

  • Explicació del projecte ENCODE: Ecker, J.R., Wendy A. Bickmore, Inês Barroso, Jonathan K. Pritchard, Yoav Gilad, Eran Segal (2012) Genomics: ENCODE explained. Nature 489, 52–55 (06 September 2012)
  • Nature Encode explorer: els 13 fils conductors, els principals temes, lligats als articles
  • Presentació del ENCODE: Skipper, M., R. Dhand, P. Campbell (2012) Presenting ENCODE. Nature 489, 45 (6 september 2012)
  • News Feature al Nature: Maher, B. (2012) ENCODE: The human encyclopaedia. Nature, News Feature 489, 46–48 (06 September 2012)
  • Nature, News & Views: Bickmore, W.A. (2012) 11 years ago: The draft human genome. Nature, News & Views, 489, 54 (06 september 2012)
  • La publicació “d’entrada” a Nature: The ENCODE Project Consortium (2012) An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature 489, 57-74 (06 september 2012).

VIDEO EXPLICANT EL PROJECTE ENCODE:

WEBS DE TREBALL DEL PROJECTE ENCODE:

ALTRES PROJECTES RELACIONATS:

I LA WIKIPEDIA:

No sé ni cómo te atreves

Fotografía y esas pequeñas cosas de cada día

Pols d'estels

El bloc d'Enric Marco

Life Secrets

For my students

All you need is Biology

Blog professional sobre Biologia · Blog profesional sobre Biología · A professional blog about Biology

Rambles of a PA student

Caffeinated forays into biological imaginings.

Horitzons llunyans

Mirades distants

#4wine

Los vinos son pequeñas historias dentro de una botella y nosotras queremos contarte las nuestras

Vi·moments·persones

Un maridatge a tres bandes

SciLogs: Artificial, naturalmente

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

microBIO

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

RealClimate

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

Què Qui Com

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

Dionís de viatge a Ítaca

Experiències enoturístiques

%d bloggers like this: