Category Archives: Vins i Enologia

Microbis domesticats per fer vi

24 agost 2022

A banda d’animals i plantes, els humans també hem anat “domesticant” alguns microbis al llarg de la història, en anar desenvolupant els aliments fermentats. Els grups principals d’aquests microorganismes són els bacteris làctics de molts productes lactis i vegetals fermentats, els llevats de les begudes alcohòliques, i les floridures d’alguns formatges i derivats de la soja. En aquest article, després d’una breu introducció, em limito sobretot als microbis del vi, o sigui, als llevats de la fermentació alcohòlica com Saccharomyces cerevisiae i als bacteris de la fermentació malolàctica com Oenococcus oeni.

DOMESTICACIÓ

Quan el flux genètic entre poblacions de la mateixa espècie es redueix, usualment per aïllament, l’evolució pot donar lloc a subpoblacions diferents, que eventualment poden esdevenir espècies diferents. Els humans poden interferir en aquest procés natural limitant el flux genètic deliberadament, seleccionant determinats trets desitjats, o sigui, la selecció artificial. D’aquesta manera, algunes espècies acaben essent dependents d’ambients antropogènics i adquireixen trets evolutius que interessen als humans. Això és la domesticació

Els trets buscats són molt diversos, des del rendiment (ex. ramaderia bovina o ovina o l’agricultura intensiva), passant per la tolerància al estrès (ex. collites resistents a sequera), fins arribar a l’estètica (ex. flors) o a la companyia (ex. gossos). Amb l’excepció dels gossos ja domesticats fa uns 30.000 anys, la majoria d’espècies domesticades ho foren durant la revolució neolítica fa uns 12.000 anys, amb el canvi de nomadisme de caçar i recol·lectar al sedentarisme lligat als conreus i al bestiar. En seleccionar els descendents d’animals i plantes que millor cobrien les necessitats específiques, aquests humans prehistòrics efectivament van començar a controlar els processos de selecció i el flux genètic (Steensels et al. 2019). 

DOMESTICACIÓ DE MICROORGANISMES

Comparat amb la de plantes i animals, la domesticació de microbis ha estat ignorada molt de temps. Recentment, el gran augment de dades genòmiques disponibles ha permès conèixer amb precisió les relacions genètiques entre diferents microorganismes, amb la qual cosa s’ha vist que els microbis industrials sovint representen branques genètiques diferenciades i aïllades als arbres filogenètics. Tanmateix, les circumstàncies ambientals que la domesticació microbiana requereix i les característiques genètiques concretes no s’han estudiat amb detall.

Curiosament, mentre que la domesticació d’animals i plantes són sobretot el resultat de l’esforç humà a posta, la domesticació dels microbis ha succeït sobretot sense intenció. Cal recordar que l’existència dels microorganismes començà a finals del s. 17 amb Antoni van Leeuwenhoek, el seu paper a les fermentacions no fou desvelat fins al s. 19 amb Louis Pasteur i altres, i sobretot els primers cultius purs, en concret de llevats cervesers, no foren obtinguts fins a finals del s. 19 per Emil C. Hansen a la Carlsberg.

Però és clar, les fermentacions són conegudes des del neolític o abans, encara que no se sabés res dels microbis com a tal. Un dels primers passos per controlar una mica el procés de fermentació fou probablement la retro-inoculació (backslopping en anglès), on s’utilitza material —i per tant microbis— d’una fermentació prèvia per començar-ne una de nova. Amb això, aquells antics artesans van promoure sense pretendre-ho l’adaptació dels microbis a l’ambient fermentatiu antropogènic, i per tant fou una selecció “inconscient”.

Al llarg del procés de domesticació dels microbis, hi ha una competència contínua entre diferents variants, ja siguin espècies, soques o mutants, a cada ronda de fermentació. O sigui, també hi ha una supervivència dels més adaptats, com a la selecció natural, encara que aquí és en un ambient controlat pels humans. En canvi, això ha canviat aquests darrers decennis des que s’utilitza la inoculació de cultius purs, seleccionats prèviament en base a les característiques volgudes. Aquesta selecció més “artificial” s’assembla més a la domesticació tradicional d’animals i plantes. La introducció de les noves eines biotecnològiques aquests darrers anys ha permès dissenyar encara millor el microorganisme amb les propietats desitjades per a la fermentació, incloent-ne algunes, com la producció d’aromes exòtics, que no necessàriament donen un avantatge adaptatiu del microbi.

Recomano la revisió de Steensels et al. (2019) per repassar les característiques del procés de domesticació als principals grups de microbis industrials, que són els bacteris làctics, els llevats i les floridures. Com he esmentat al principi, aquí em centraré sobretot en els relacionats amb el procés de vinificació, o sigui llevats i bacteris làctics, i per aquest ordre, de rellevància i temporalitat al vi.

DOMESTICACIÓ DELS LLEVATS

Els llevats són fongs unicel·lulars, i per tant microscòpics. Tenen uns 4 micròmetres de diàmetre, encara que alguns poden arribar fins a 40 µm, i ocasionalment alguns fan prolongacions o cadenes de cèl·lules conegudes com pseudohifes. Es reprodueixen sobretot asexualment per mitosi amb gemmació, una divisió asimètrica on el llevat fill més petit és la gemma. En condicions d’estrès poden esporular i després de la meiosi es produeixen espores haploides, que poden conjugar. La majoria són ascomicets però també n’hi ha de basidiomicets, i encara que hi ha unes 1500 espècies de llevats, el “llevat” per antonomàsia és Saccharomyces cerevisiae.

Encara que no exclusius del vi, els llevats S. cerevisiae són el model perfecte de domesticació microbiana perquè, malgrat ser eucariotes, tenen un genoma petit (12 Mb i 6500 gens, enfront la mitjana als ascomicets que és de 36 Mb i 11000 gens) i ben estudiat, temps de generació curts i es disposa de moltes eines per fer-hi recerca genètica i fenotípica.

S. cerevisiae només és abundant a les fermentacions de fruita recollida artificialment, com als raïms veremats un cop són al celler. En canvi, de forma natural s’ha trobat a molts hàbitats però en nombres escassos, i en particular a les fruites, al raïm mateix, i a l’escorça dels roure, que semblen ser els seus nínxols ecològics, però en qualsevol cas en nombres escassos (Steensels et al. 2019).

Per això s’ha proposat que S. cerevisiae no és que estigui adaptat a cap nínxol específic sinó que es pot dir que és una espècie nòmada, capaç de sobreviure com a generalista poc abundant en un ample ventall d’ambients. Pot sobreviure en molt diverses condicions i encara que el seu genoma és petit, és força complex i de fet per créixer als medis de laboratori només li calen el 20% dels seus 6500 gens (Goddard & Greig 2015).

Però malgrat no tenir clar quin és el seu hàbitat natural, està clar que el seu segon hàbitat són molts ambients artificials de fermentacions com les de pa, cervesa i viS. cerevisiae és conegut per les seves excel·lents característiques fermentatives, fins i tot en presència d’oxigen. Aquest caràcter sorgí com un procés evolutiu, adquirint la capacitat de créixer en medis amb molts sucres però amb pocs dels altres nutrients, i de convertir aquests diversos sucres a etanol, un compost antimicrobià per al qual aquest llevat és molt tolerant. El vi es considera la primera beguda fermentada alcohòlica, de fa uns 9000 anys (Fay et al. 2019). Amb tot, S. cerevisiae no és la única espècie per produir begudes alcohòliques, vins inclosos, ja que també ho són altres Saccharomyces relacionats: S. uvarumS. eubayanusS. kudriavzevii i altres derivats híbrids (González et al. 2006)

Com que l’etanol és un bon preservatiu natural enfront de microbis no desitjats, i addicionalment té la capacitat de ser una substància addictiva, la fermentació d’aliments per llevats va esdevenir una pràctica ben estesa, i va sorgir independentment en diverses civilitzacions arreu del món.

Per estudiar el probable origen de S. cerevisiae i la relació entre les seves diverses soques, en un estudi recent de seqüenciació i anàlisi dels SNPs (polimorfismes d’un sol nucleòtid) de més de 600 soques d’aquesta espècie (Duan et al. 2018) s’ha vist que les soques silvestres, de diversos continents però sobretot de la Xina, se separen quasi totes de les domesticades, excepte les aïllades en roures i altres Quercus, que són més properes als de les soques pròpies de vins i de cerveses (Figura 1). Com veiem, les soques domesticades es distribueixen en 2 branques evolutives. Una branca agrupa soques de fermentacions en estat sòlid, sobretot d’Àsia i en particular de la Xina. I l’altra inclou les pròpies de fermentacions líquides com els vins i les cerveses i altres, a més de les esmentades dels Quercus. Tot plegat, els autors (Duan et al. 2018) postulen un hipotètic origen de l’espècie, i sobretot de la seva domesticació, a la Xina o l’est asiàtic en general. 

Figura 1. Esquema de l’arbre filogenètic de soques de S. cerevisiae (adaptat de Steensels et al. 2019 i Duan et al. 2018).

Aquesta proximitat evolutiva de les soques de S. cerevisiae del vi amb les dels Quercus podria ser perquè aquests arbres fossin l’origen silvestre de les víniques o també perquè hi hagués hagut un retorn a la natura d’alguna soca vínica (Steensels et al. 2019).

Les soques de llevats domesticades dels diversos processos en estat líquid, o industrials “europees”, a més de ser diferents de les silvestres, s’agrupen filogenèticament força amb l’aplicació industrial, ja sigui cervesa o vi (Figura 2). Les soques domesticades de S. cerevisiae tenen reforçats uns trets que les fan idònies per a l’ambient fermentatiu, com l’adaptació a concentració alta de sucres, ambients amb poc O2 i tolerància a l’etanol, però també alguns trets específics del producte. Per exemple, els llevats cervesers poden metabolitzar maltotriosa, sucre específic del malt, mentre que els llevats vínics tenen una bona resistència als agents antimicrobians emprats, el sulfat de coure a la vinya i el sulfurós al celler. Com veiem (Figura 2), els S. cerevisiae del vi tenen una domesticació més limitada que els cervesers. Per exemple, els cervesers han perdut la capacitat de supervivència fora de l’entorn fermentatiu, mentre que els vínics poden esporular i sobreviuen a l’entorn extern. Això segurament és degut a que la fermentació del vi només passa un cop cada any, després de la verema, i la resta de l’any els llevats han de sobreviure al celler o a l’entorn en un ambient més natural (Steensels et al. 2019).

Figura 2. Filogènia i domesticació dels llevats industrials (Gallone et al 2016).

Cal afegir a aquestes diferències entre els llevats vínics i els cervesers, la molt més gran diversitat gènica dels llevats cervesers. De fet, molts d’aquests són S. cerevisiae, que inclouen els anomenats d’alta fermentació com els de les cerveses ale i stout i moltes més de tot el món, però justament les cerveses de baixa fermentació lager, que són el 94% del mercat mundial, són dutes a terme per S. pastorianus (sinònim S. carlsbergensis), per tant una altra espècie. Aquest S. pastorianus és un híbrid al·lotetraploïde de S. cerevisiae amb el llevat criotolerant S. eubayanus, i s’originà domèsticament cap al segle 15 a Baviera sotmetent les cerveses a baixes temperatures de coves dels Alps. Per això aquest llevat actua a 7-13ºC, i al fons del fermentador (Libkind et al. 2011). 

Totes les altres cerveses d’alta fermentació són elaborades amb molt diverses S. cerevisiae, constituint un grup polifilètic, amb moltes branques evolutives, algunes de les quals són filogenèticament properes a les del sake, del vi i del pa. La diversitat de nucleòtids dels S. cerevisiae cervesers és més del doble que la dels vínics. Aquesta major diversitat segurament és deguda a la suara comentada utilització estacional dels llevats vínics a diferència dels cervesers tot l’any, i també als més intensos i diferents règims de selecció associats a la seva elaboració (Gonçalves et al. 2016).

Amb tot això, tenim l’aparent paradoxa que les cerveses, com que la majoria de les consumides són lager, i moltes d’elles produïdes a gran escala industrial, semblen ser més estandarditzades comercialment i per tant més uniformes, i en canvi els vins semblen ser més diversos, en contra del que acabem de veure de la molt major diversitat de soques de llevats cerveseres que víniques. 

CANVIS GENÈTICS CAP A LA DOMESTICACIÓ DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE DEL VI

En centrar-nos en el vi, cal recordar que en començar la fermentació espontània del most de raïm les soques de S. cerevisiae no són predominants i hi ha un ampli espectre d’altres llevats, coneguts com no-Saccharomyces: Hanseniaspora, Pichia, Lachancea, Metschnikowia o Torulaspora i altres gèneres (Fleet et al. 1984). Per efecte de la producció d’etanol, S. cerevisiae acaba predominant i desplaçant en nombre a las no-Saccharomyces. Encara que cada cop més s’estan veient els beneficis d’aquests altres llevats a nivell d’aromes i s’estan utilitzant com a estàrters addicionals a S. cerevisiae (Jolly et al. 2014), no es pot parlar de la domesticació d’aquests no-Saccharomyces perquè no tenen fins ara un paper primordial en la vinificació, no es pot elaborar cap vi només amb aquests altres llevats. Per tant aquí em limitaré a S. cerevisiae

Molts dels mecanismes de canvis genètics que han portat a la domesticació de S. cerevisiae a la vinificació són presents també en altres espècies domesticades, tant microbianes com animals i plantes. El mecanisme més fàcil d’establir com a canvi genètic són els SNPs, degudes a mutacions puntuals d’un sol nucleòtid, però s’ha vist que aquests SNPs representen tan sols una petita fracció dels relacionats amb la domesticació de S. cerevisiae, i en canvi la majoria són rearranjaments estructurals del genoma, com els següents.

Les variacions en el nombre de còpies (CNV en anglès) són mutacions molt freqüents a molt diversos organismes, on fragments de DNA de > 1kb són repetits, tenen diverses còpies, amb nombre variable. El cas més conegut en els llevats vínics és el gen CUP1, que codifica per a una metal·lotioneïna, proteïna captadora de coure. Algunes soques poden tenir fins a 18 còpies d’aquest gen, amb la qual aquests S. cerevisiae vínics produeixen més quantitat de la proteïna i per tant són més tolerants al coure de la “barreja de Bordeus” usada com a fungicida a les vinyes (Steensels et al 2019).

Els rearranjaments cromosòmics, amb delecions, insercions o translocacions de grans fragments de cromosomes, sovint causades per transposons, són relativament freqüents en l’evolució dels llevats vínics i de Saccharomyces en general. De fet, aquests rearranjaments que poden afectar un nombre important de gens són una causa important de especiació. Un exemple n’és la tolerància al sulfit —l’antibacterià més usat en vinificació— degut a l’al·lel SSU1-R que és el producte sobreexpressat d’una translocació entre els cromosomes 8 i 16, només present als llevats vínics (Pérez-Ortín et al. 2002).

La hibridació interespecífica és un altre mecanisme de canvis que ja hem vist com a origen dels llevats domesticats a les cerveses lager. Les espècies de Saccharomyces poden hibridar molt fàcilment entre elles ja que aquests híbrids poden propagar-se per mitosi tan eficientment com els seus progenitors, encara que rarament poden fer la meiosi i per tant, quasi mai produeixen espores viables (Sipiczki 2008). Malgrat això, alguns dels llinatges híbrids poden acabar ser reconeguts com a espècies. Els casos més coneguts són l’esmentat S. pastorianus (sinònim S. carlsbergenesis) (S. cerevisiae x S. eubayanus) de les lager, i els S. bayanus (S. cerevisiae x S. eubayanus x S. uvarum) del vi (Figura 3). Tanmateix, S. bayanus és controvertit per les seves similituds amb S. cerevisiae i genera confusió de noms d’espècies amb alguna de les soques comercials més utilitzades (Sipiczki 2008).

Figura 3. Cladograma del gènere Saccharomyces amb les seves 8 espècies i 2 de les espècies híbrides, S. pastorianus i S. bayanusS. paradoxus inclou conjunts de soques originades a diferents continents. Modificat de Ono et al. (2020).

Els híbrids també han estat clau en l’aparició de força llevats vínics, sobretot en relació a la possibilitat de fermentar a baixes temperatures. Per exemple, algunes de les soques comercials d’estàrters que fermenten vi a 15ºC són híbrids “naturals” de S. cerevisiae amb S. kudriavzevii amb poliploïdia parcial, aïllats el 1979, que tenen la bona producció d’etanol de S. cerevisiae i la tolerància al fred de S. kudriavzevii (Erny et al. 2012).

De fet, recentment la hibridació interespecífica de diversos Saccharomyces vínics —per exemple S. cerevisiae x S. uvarum— s’està realitzant als laboratoris per tal d’aconseguir soques amb millors característiques relacionades amb caràcters poligènics. La hibridació com a mètode té l’avantatge de no ser considerada una tècnica GMO (organisme modificat genèticament, en anglès) i per tant les soques poden ser transferides ràpidament a la indústria (García-Ríos et al. 2019).

La transferència genètica horitzontal (TGH) és un altre mecanisme molt important evolutivament en molts organismes i en els llevats vínics també se’n coneixen alguns casos que han contribuït a la seva domesticació. Un cas és el gen Fsy1 codificant del transportador de fructosa, que permet a S. cerevisiae la utilització de la fructosa al final de fermentació, després d’haver consumit la glucosa. És molt probable que aquest gen li fou transferit del similar de S. pastorianus, per al que presenta molta homologia (Galeote et al. 2010). Un altre cas demostrat de TGH és el del gen Fot originari d’un altre llevat, Torulaspora microellipsoides, que li permet a S. cerevisiae una millor incorporació d’oligopèptids, que li donen avantatge competitiu quan les fonts de nitrogen són escasses (Marsit et al. 2015).

LLEVATS del VI DOMESTICATS o TORNEM ALS SILVESTRES ?

Malgrat els avantatges en la fermentació del vi que ha suposat l’ús d’aquests llevats evolucionats, això ha comportat una certa uniformització en les característiques del vi, sobretot a nivell d’aromes, perquè la majoria dels llevats utilitzats pertanyen a un sol llinatge genètic de S. cerevisiae domesticat. Com a contramoviment a això i també pel desig general de productes més “naturals” o ecològics, darrerament hi ha una tendència a utilitzar microorganismes silvestres i/o autòctons enlloc de les soques “domesticades”, o deixar més les fermentacions espontànies. Això passa amb el vi però també amb la cervesa i altres begudes i aliments fermentats (Steensels et al. 2014). En el vi, la tendència principal és sobretot l’ús de llevats no-Saccharomyces, presents de forma natural a l’inici de la fermentació, com he comentat abans, que donen perfils aromàtics diferents i molt interessants (Padilla et al. 2016). I encara més, els avenços en la comprensió de la domesticació combinats amb les noves tècniques disponibles per a l’evolució dirigida de microorganismes possibilitaran la creació de nous llinatges domesticats (Steensels et al. 2019).

———————–

DOMESTICACIÓ DELS BACTERIS LÀCTICS

El vi, juntament amb la cervesa i el pa, són els productes principals lligats a la domesticació comentada del llevat, S. cerevisiae bàsicament, amb algun altre molt relacionat com hem vist. Per tant, tenim unes poques espècies d’un sol gènere amb una gamma limitada de productes. En canvi, els bacteris làctics (BL) comprenen moltes espècies i ben diverses, que intervenen a molt diversos productes, tant derivats de la llet com de vegetals i d’altres aliments (Taula 1), molts més que els 3 bàsics dels llevats. Paradoxalment i tanmateix, al vi pràcticament només tenim una sola espècie de bacteri làctic domesticat, Oenococcus oeni, com tot seguit comentaré.

Els BL són bacteris gram-positius, de baix G+C al seu DNA, no esporulats, de metabolisme fermentatiu sense respiració, que produeixen àcid làctic com a producte principal de la fermentació de carbohidrats. Del punt de vista taxonòmic són l’ordre Lactobacillales, de la classe Bacilli, dins el fílum Firmicutes. Els seus hàbitats naturals són moltes plantes, especialment els fruits rics en sucres, i els animals, especialment els mamífers i entorn les seves llets, però també a l’interior dels seus cossos, com a la microbiota de boca i digestiu.

Els BL són el grup de microorganismes més important en la producció d’aliments i begudes fermentats, als que contribueixen en aroma, textura, seguretat i qualitat. La seva domesticació fou clau en la conservació d’aliments, i va resultar en molts cultius iniciadors per a la producció d’aliments industrials fermentats.

A nivell industrial, els productes làctics més coneguts són els lactis o derivats de la llet (Taula 1), on els BL predominants són Lactococcus i diversos gèneres actuals derivats de Lactobacillus (Zheng et al. 2020). En aquests dos grups, la domesticació va anar associada a pèrdua de gens de rutes biosintètiques —d’aminoàcids per exemple— i d’estrès oxidatiu, així com adquisició per TGH de gens per a un creixement òptim en l’ambient lacti, com els d’utilització de caseïna i de lactosa (Bonham et al. 2017).

Taula 1. Aliments (i begudes) fermentats amb intervenció de bacteris làctics (BL). Els BL o bacteris de l’àcid làctic (BAL, en anglès LAB) són de l’ordre Lactobacillales del fílum Firmicutes. Taula modificada i adaptada de Leroy & de Vuyst (2004). S’ha exclòs Bifidobacterium, que hi era a l’original, perquè no es dels Lactobacillales sinó del fílum Actinobacteria. S’han actualitzat els nous noms del gènere Lactobacillus (Zheng et al 2020).

Tipus de producteProducte fermentatBL predominants a, b
Productes lactisFormatges Lc. lactis, Le. mesenteroides, Lb. delbrueckii, Lb. helveticus, Lcb. casei, St. thermophilus
 Mantega i similarsLc. lactis, Le. mesenteroides
 IogurtLb. delbrueckii, St. thermophilus
 Altres llets fermentades cLcb. casei, Lb. acidophilus, Lcb. rhamnosus, Lb. johnsonii
 QuefirLnb. kefiri, Lb. kefiranofaciens, Lvb. brevis
Carns fermentadesEmbotits europeusLtb. sakei, Ltb. curvatus
 Embotits USAP. acidilactici, P. pentosaceus
Peix fermentatPlaa-som, bagoóng, garum i altresClb. alimentarius, C. piscicola
Vegetals fermentatsXucrutLe. mesenteroides, Lpb. plantarum, P. acidilactici
 OlivesLpb. pentosus, Lpb. plantarum, Le. mesenteroides
 Envinagrats: cogombrets, albergínies i altresLe. mesenteroides, P. cerevisiae, Lvb. brevis, Lpb. plantarum
 KimchiLe. mesenteroides, Le. kimchii, Ltb. sakei, Lpb. plantarum, W. kimchii, P. pentosaceus
 Salsa de sojaT. halophilus
Cereals fermentatsMassa mareFlb. sanfranciscensis, Lvb. brevis, Lpb. plantarum
Begudes alcohòliquesFermentació malolàctica del viO. oeni
 Vi d’arròsLtb. sakei
 Cerveses làmbic o similarsPediococcus spp.
Gèneres: C.=Carnobacterium, Lc.=Lactococcus, Lb.=Lactobacillus, Lcb.=Lacticaseibacillus, Lnb.=Lentilactobacillus, Lvb.=Levilactobacillus, Ltb.=Latilactobacillus, Clb.=Companilactobacillus, Lpb.=Lactiplantibacillus, Flb.=Fructilactobacillus, Le.=Leuconostoc, O.=Oenococcus, P.=Pediococcus, St.=Streptococcus, T.=Tetragenococcus, W.=Weissella.
b A banda de possibles altres microorganismes no BL
c Incloent les de probiòtics afegits

——————–

BACTERIS LÀCTICS DEL VI, OENOCOCCUS OENI I LA SEVA DOMESTICACIÓ

De la mateixa manera que amb els llevats, com que les fermentacions víniques no són estèrils, al most poden haver-hi molt diversos bacteris, incloent els BL. D’aquests, els més habituals durant la fermentació alcohòlica, si bé en nombres baixos —inferiors a 104 UFC/mL—, són Oenococcus oeniLactiplantibacillus plantarumLentilactobacillus hilgardiiLevilactobacillus brevisFructilactobacillus lindneriPediococcus parvulus i algun altre (Capozzi et al. 2021).

Però al final de la FA, quan el contingut d’etanol produït pels llevats ja és superior a 10% (v/v), aleshores la gran majoria de bacteris inclosos quasi tots els BL són inhibits, i pràcticament només hi romanen —i hi poden créixer lleugerament— les soques de O. oeni (Franquès et al. 2017), que duen a terme la fermentació malolàctica (FML) o conversió de L-màlic a L-làctic. Aquesta FML té els beneficis de reducció de l’acidesa, millora organolèptica i estabilitat microbiològica del vi (Bartowsky 2008). A banda de O. oeni, ocasionalment en alguns vins la FML pot ser duta a terme per altres BL, sobretot per Lpb. plantarum (Krieger-Weber et al. 2020).

Per tant, Oenococcus oeni és el bacteri del vi per excel·lència, degut a la seva tolerància a l’etanol i la capacitat de sobreviure en un medi àcid i amb polifenols i amb ben pocs nutrients com és el vi. La seva excepcionalitat està clar que va lligada a la seva domesticació —involuntària per als humans— i adaptació a aquest entorn artificial del vi durant aquests darrers milers d’anys.

CANVIS GENÈTICS CAP A LA DOMESTICACIÓ DE OENOCOCCUS OENI AL VI

Els bacteris gram-positius amb fermentació heterolàctica de sucres i forma de coc que realitzen la FML del vi foren classificats com Leuconostoc oenos per Garvie (1967) per la semblança amb altres Leuconostoc. Tanmateix, els del vi es distingeixen dels altres Le. pel creixement en medi àcid, la tolerància a l’etanol, i la pobre fermentació de carbohidrats, a més de les estructures diferenciades d’enzims clau com la D-lactat deshidrogenasa o la glucosa-6-fosfat deshidrogenasa. L’estudi filogenètic del gen 16S rRNA per Yang & Woese (1989) va revelar una línia ben diferenciada d’aquests bacteris del vi respecte a altres Leuconostoc i d’altres BL (Figura 4). Aquests autors ja observaren que la seqüència del 16S rRNA de “Le. oenos“, a més de ser molt distant de tots els altres Leuconostoc, tenia inusualment alterada la composició en posicions altament conservades. Per tot això Dicks et al. (1995) van proposar el nou nom de gènere i espècie Oenococcus oeni

Figura 4. Arbre filogenètic de O. oeni amb altres BL en base a les seqüències del gen 16S rRNA. Weissella, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus. Adaptat de Dicks et al. (1995).

Aquesta branca filogenètica ben llarga i diferenciada de O. oeni és indicativa de la ràpida evolució que aquest bacteri ha experimentat en la domesticació i adaptació al vi. Les característiques genòmiques principals d’aquesta espècie respecte a altres BL són d’una reducció gènica a tots els nivells (Makarova et al. 2006), la qual cosa es correspon amb la molt menor capacitat biosintètica (aminoàcids, vitamines, etc.):

  • El genoma de O. oeni és de 1.78 Mbp, el més petit dels BL, que van de 1.8 de diversos Streptococcus a 3.3 de Lpb. plantarum.
  • El nombre d’operons rRNA de O. oeni és 2, el menor de tots els BL, ja que alguns com Lb. delbrueckiii en tenen 9.
  • El nombre de tRNAs de O. oeni és 43, el menor de tots els BL, enfront de 55-98 dels altres, relacionat amb el menor creixement i la menor competitivitat ecològica.

A banda de la reducció gènica, a Oenococcus s’observen taxes més elevades de mutacions que a d’altres BL, és un gènere hipermutable (Taula 2). La causa és que hi són absents els gens mutS i mutL, que són gens de reparació d’errors d’aparellament (MMR, mismatch repair), mentre que aquests gens són presents a tots els altres BL. El tipus de mutacions més freqüent són les transicions (GC –> AT i AT –> GC). Això explica l’alt nivell de polimorfisme al·lèlic, que probablement va conduir a la seva adaptació als ambients àcids i amb etanol (Marcobal et al. 2008). L’alta mutabilitat devia generar algunes mutacions beneficioses per a ambients molt restrictius com és el vi, a diferència d’altres BL, com per ex. Leuconostoc o Pediococcus, que es troben en molt diversos hàbitats. A més, el gènere Oenococcus és un exemple de com la manca dels gens MMR pot portar a la especiació.

Taula 2. Hipermutabilitat de O. oeni respecte a altres BL (adaptat de Marcobal et al. 2008)

EspècieTaxes de mutació espontània amb rifampicinaTaxes de mutació espontània amb eritromicina% Transicions (GC-AT i AT-GC) / total mutacions
Oenococcus oeni1.6 x 10-61.6 x 10-683
Leuconostoc mesenteroides1.5 x 10-84.2 x 10-928
Pediococcus pentosaceus5.5 x 10-84.7 x 10-933

Aquesta hipermutabilitat ha originat la gran diversitat de soques de O. oeni que trobem en totes les regions vinícoles mundials, i quan s’estudien els seus genomes per diversos mètodes moleculars com els SNP (polimorfismes d’únic nucleòtid), s’observen (Figura 5) agrupacions de soques relacionades amb el tipus de producte, com les de xampany o de la sidra —on també és present aquest bacteri—, resultat de la domesticació-adaptació als diversos ambients on realitza la FML. També es troba O. oeni com a BL predominant a la kombutxa, la beguda de té fermentat per una comunitat de llevats, acètics i soques específiques de O. oeni i altres BL (Lorentzen & Lucas 2019).

Figura 5. Reconstrucció filogenòmica de soques de O. oeni en base als SNP (polimorfismes d’únic nucleòtid). Les soques procedents del mateix producte (sidra, xampanya) queden agrupades. Adaptat de Campbell-Sils et al. (2015).

OENOCOCCUS OENI, EL BACTERI DOMESTICAT QUASI NOMÉS PRESENT AL VI

Aquesta és potser l’evidència més clara de què O. oeni és un bacteri producte de la domesticació. De manera semblant al cas dels llevats i en aquest cas es pot dir que encara amb més certesa, és molt difícil trobar O. oeni fora del vi en ambients naturals. Les poblacions de BL al most de raïm són com a molt 104/mL, i O. oeni només és una petita part d’aquests. Hi ha molts pocs estudis on se’ls hagi pogut aïllar dels raïms o del most. En destaca el treball recent de Franquès et al. (2017) on s’aconseguiren aïllar-ne diverses soques al Priorat. Algunes d’aquestes foren també aïllades als mateixos vins, i es confirmà la presència del DNA d’O. oeni als mateixos raïms. 

Malgrat la minsa presència d’aquest bacteri als raïms i al most, un cop la fermentació alcohòlica està acabant i el vi conté una quantitat significativa d’etanol produït pels llevats, els pocs inicials O. oeni poden haver assolit unes poblacions suficients per realitzar la FML. A banda del most, també és molt probable que els bacteris ja hi siguin al celler, a les superfícies o interior dels equipaments, ja que s’han detectat soques comercials de O. oeni a cellers on se n’havia utilitzat anys abans (Lorentzen & Lucas 2019).

CONCLOENT, LA DOMESTICACIÓ INCONSCIENT DELS MICROBIS DEL VI HA GENERAT DOS MOLT EXCEPCIONALS

El llevat Saccharomyces cerevisiae és l’espècie principal implicada a la fermentació alcohòlica del vi, i el bacteri làctic Oenococcus oeni ho és per a la fermentació malolàctica. En canvi, abans de les fermentacions respectives quasi no hi són. Si no s’inoculen estàrters, els nombres de S. cerevisiae són molt baixos al most, i O. oeni pràcticament no apareix al vi fins al final de la fermentació alcohòlica. Per tant, es pot dir que si els humans no haguessin començat a fer vi —i cervesa en el cas dels llevats— fa alguns milers d’anys, aquestes dues espècies segurament no existirien. Són clarament microbis domesticats en el sentit que han aparegut evolutivament en un temps relativament breu com a derivats de microbis previs que no tenien les característiques específiques d’aquests dos.

Com hem vist, l’excepcionalitat de Saccharomyces (“el fong del sucre”), i en particular S. cerevisiae, és sobretot la capacitat de fermentar medis amb molts sucres, convertint-los a etanol en quantitats importants, per al qual aquest llevat és molt tolerant. Aquesta producció d’etanol és bioquímicament excepcional i única entre els fongs i els altres organismes. Vegeu al respecte el treball de Dashko et al. (2014) sobre l’evolució de la fermentació alcohòlica als llevats.

L’excepcionalitat d’O. oeni (“el coc del vi del vi”) també és ben evident. És una espècie “nascuda i modelada” al vi (Bech-Terkilsen et al. 2020), capaç de sobreviure en un medi ben hostil, amb etanol, pH baix i molt pocs nutrients. Hi subsisteix gràcies al L-màlic i algunes restes de les cèl·lules de llevats, com és el cas de les manoproteïnes (Balmaseda et al. 2021), i és resistent a l’estrès d’aquestes condicions extremes gràcies a algunes proteïnes protectores del xoc de l’etanol, als sistemes antioxidants com el glutatió (Margalef-Català et al. 2016), i també en part degut a l’acumulació de manganès —també antioxidant, i molt poc estudiat—, el qual a més és cofactor de l’enzim malolàctic (Makarova et al. 2006). Per tot això, O. oeni pot ser una espècie model d’estrès per als altres BL (Liu 2002).

BIBLIOGRAFIA

Balmaseda A, Aniballi L, Rozès N, Bordons A, Reguant C (2021) Use of yeast mannoproteins by Oenococcus oeni during malolactic fermentation under different oenological conditions. Foods 10, 1540

Bartowsky EJ (2008) Oenococcus oeni and malolactic fermentation —moving into the molecular arena. Aust J Grape Wine Res 11: 174-187

Bech-Terkilsen S, Westman J, Swiegers J, Siegumfeldt H (2020) Oenococcus oeni, a species born and moulded in wine: a critical review of the stress impacts of wine and the physiological responses. Aust J Grape Wine Res 26, 188-206

Bonham KS, Wolfe BE, Dutton, R.J. (2017) Extensive horizontal gene transfer in cheese-associated bacteria. Elife 6, e22144

Campbell-Sills H, El Khoury M, Favier M, Romano A, Biasioli F et al. (2015) Phylogenomic Analysis of Oenococcus oeni Reveals Specific Domestication of Strains to Cider and Wines. Genome Biol Evol 7, 1506–1518

Capozzi V, Tufariello M, De Simone N, Fragasso M, Grieco F (2021) Biodiversity of Oenological Lactic Acid Bacteria: Species- and Strain-Dependent Plus/Minus Effects on Wine Quality and Safety. Fermentation 7, 24

Dashko S, Zhou N, Compagno C, Piškur J (2014) Why, when, and how did yeast evolve alcoholic fermentation?. FEMS Yeast Res, 14, 826–832

Dicks LMT, Dellaglio F, Collins MD (1995) Proposal to reclassify Leuconostoc oenos as Oenococcus oeni [corrig.] gen. nov., comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 45, 395–397

Duan SF, Han PJ, Wang QM, Liu WQ, Shi JY et al (2018). The origin and adaptive evolution of domesticated populations of yeast from Far East Asia. Nat. Commun. 9, 2690

Erny C, Raoult P, Alais A, Butterlin G, Delobel P et al. (2012) Ecological Success of a Group of Saccharomyces cerevisiae/Saccharomyces kudriavzevii Hybrids in the Northern European Wine-Making Environment. Appl Environ Microbiol 78, 9

Fay JC, Liu P, Ong GT, Dunham MJ, Cromie GA et al. (2019) A polyploid admixed origin of beer yeasts derived from European and Asian wine populations. PLoS Biol 17(3): e3000147

Fleet GH, Lafon-Lafourcade S, Ribereau-Gayon P (1984). Evolution of yeasts and lactic acid bacteria during fermentation and storage of Bordeaux wines. Appl Environ Microbiol 48, 1034–1038

Franquès J, Araque I, Palahí E, Portillo MC, Reguant C, Bordons A (2017) Presence of Oenococcus oeni and other lactic acid bacteria in grapes and wines from Priorat (Catalonia, Spain). LWT Food Sci Technol 81, 326-334

Galeote V, Novo M, Salema-Oom M, Brion C, Valerio E et al. (2010) FSY1, a horizontally transferred gene in the Saccharomyces cerevisiae EC1118 wine yeast strain, encodes a high-affinity fructose/H+ symporter. Microbiology 156, 3754–3761

Gallone B, Steensels J, Prahl T, Soriaga L, Saels V et al (2016) Domestication and divergence of Saccharomyces cerevisiae beer yeasts. Cell 166, 1397–1410.e1316

García-Ríos E, Guillén A, de la Cerda R, Pérez-Través L, Querol A, Guillamón JM (2019) Improving the Cryotolerance of Wine Yeast by Interspecific Hybridization in the Genus Saccharomyces. Front Microbiol 9, 3232

Garvie EI (1967) Leuconostoc oenos sp. nov. J Gen Microbiol 48, 431–438

Goddard MR, Greig D (2015) Saccharomyces cerevisiae: a nomadic yeast with no niche ? FEMS Yeast Res. 15, 1–6

Gonçalves M, Pontes A, Almeida P, Barbosa R, Serra M et al (2016) Distinct Domestication Trajectories in Top-Fermenting Beer Yeasts and Wine Yeasts, Current Biology 26, 2750-2761

González SS, Barrio E, Gafner J, Querol A (2006) Natural hybrids from Saccharomyces cerevisiae, S. bayanus and S. kudriavzevii in wine fermentations. FEMS Yeast Res 6, 1221–1234

Krieger-Weber S, Heras JM, Suarez C (2020) Lactobacillus plantarum, a New Biological Tool to Control Malolactic Fermentation: A Review and an Outlook. Beverages 6, 23

Leroy F, De Vuyst L. (2004). Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry. Trends Food Sci Technol 15, 67–78

Libkind D, Hittinger CT, Valério E, Gonçalves C, Dover J et al (2011). Microbe domestication and the identification of the wild genetic stock of lager-brewing yeast. Proc Nat Acad Sci, 108(35), 14539-14544

Liu SQ (2002) A review: Malolactic fermentation in wine — Beyond deacidification. J Appl Microbiol 92, 589–601

Lorentzen MPG, Lucas PM (2019) Distribution of Oenococcus oeni Populations in Natural Habitats. Appl Microbiol Biotechnol 103, 2937–2945

Jolly NP, Varela C, Pretorius IS (2014) Not your ordinary yeast: non-Saccharomyce yeasts in wine production uncovered. FEMS Yeast Res, 14, 215–237

Makarova K, Slesarev A, Wolf Y, Sorokin A, Mirkin B et al. (2006) Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103:15611–15616

Marcobal AM, Sela DA, Wolf YI, Makarova KS, Mills DA (2008) Role of hypermutability in the evolution of the genus Oenococcus. J Bacteriol 190, 564-570

Margalef-Català M, Araque I, Weidmann S, Guzzo J et al. (2016) Protective roles of glutathione addition against wine-related stress in Oenococcus oeni. Food Res Internat 90, 8-15

Marsit S, Mena A, Bigey F, Sauvage F, Couloux A. et al. (2015) Evolutionary advantage conferred by an eukaryote-to-eukaryote gene transfer event in wine yeasts. Mol Biol Evol 32, 1695–1707

Ono J, Greig D, Boynton PJ (2020) Defining and Disrupting Species Boundaries in Saccharomyces. Ann Rev Microbiol 74,477-495

Padilla B, Gil JV, Manzanares P (2016) Past and future of non-Saccharomyces yeasts: from spoilage microorganisms to biotechnological tools for improving wine aroma complexity. Front Microbiol 7, 411

Pérez-Ortı́n JE, Querol A, Puig S, Barrio E (2002) Molecular Characterization of a Chromosomal Rearrangement Involved in the Adaptive Evolution of Yeast Strains. Genome Res 12, 1533-1539

Steensels J, Gallone B, Voordeckers K, Verstrepen KJ (2019) Domestication of industrial microbes. Curr Biol 29 R381 (Review) 

Sipiczki M (2008) Interspecies hybridization and recombination in Saccharomyces wine yeasts. FEMS Yeast Res 8, 996-1007

Steensels J, Snoek T, Meersman E, Picca Nicolino M et al (2014) Improving industrial yeast strains: exploiting natural and artificial diversityFEMS Microbiol Rev 38, 947–995

Yang D, Woese CR (1989) Phylogenetic structure of the ‘‘Leuconostocs’’: an interesting case of a rapidly evolving organism. Syst Appl Microbiol 12, 145–149

Zheng J, Wittouck S, Salvetti E et al (2020) A taxonomic note of the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostococaceae. Int J Syst Evol Microbiol 004107

Llevats vius aïllats de 3000 anys i altres històries de cèl·lules dorments

Click here for the English version: “Yeasts 3000-years-old are alive …

2 agost 2019

Fa uns mesos, cap a l’abril, l’amic arqueòleg i professor de la URV Jordi Diloli em va passar un article molt i molt sorprenent (Aouizerat et al 2019), que tot seguit passo a comentar, i del qual se n’ha fet ressò a internet (Borschel-Dan 2019).

Llevats “ressuscitats” de fa 3000 anys

El grup d’investigadors dirigit per Ronen Hazan de la Universitat Hebrea de Jerusalem van prendre mostres de 21 recipients de diversos jaciments de l’actual Israel de fa entre 2500 i 5000 anys, dels períodes persa, filisteu i els més antics de l’egipci. Els arqueòlegs creien que aquests recipients d’argila havien contingut begudes fermentades com cervesa o hidromel (Figura 1). Els recipients foren submergits en medi ric YPD, específic per a créixer llevats i altres fongs, i posats a incubar a temperatura ambient durant 7 dies. A continuació, mostres d’aquest medi foren sembrades en plaques d’agar amb el medi específic, i les colònies resultants foren aïllades per a les anàlisis posteriors (Aouizerat et al 2019).

Fig 1 pottery Hazan

Figura 1. Recipients d’argila d’on es van aïllar els llevats (Imatge de Judah Ari Gross, Times of Israel).

 

Els aïllats trobats foren 6 soques de diferents espècies de llevats, i una d’elles era de Saccharomyces cerevisiae, en concret d’un jaciment filisteu de fa 3000 anys. Evidentment, és molt sorprenent que s’hagin pogut aïllar llevats vius d’unes restes tan antigues. Per això, els autors del treball van dur a terme una sèrie d’experiments que poguessin confirmar aquest fet tan singular i que els aïllats no fossin producte d’una contaminació.

En primer lloc Aouizerat et al (2019) van demostrar que és possible aïllar llevats de recipients d’argila que han contingut cervesa o vi després d’un cert temps. Ho van fer tant amb recipients amb cervesa sense filtrar enterrats durant 3 setmanes, i també amb un altre recipient que havia contingut repetidament vi i que feia 2 anys que no s’utilitzava. Amb aquestes mostres van posar a punt la metodologia d’aïllament i en ambdós casos van aconseguir aïllar llevats, i no en van aïllar d’una mostra control amb cervesa filtrada, per tant sense llevats.

Per demostrar que els aïllats dels recipients antics ho eren perquè aquests havien contingut el líquid fermentat, van aplicar el mateix protocol amb mostres d’altres ceràmiques que era segur que no havien estat per a aquesta finalitat, i també de sediments propers als recipients. El resultat fou clarament negatiu per a aquestes mostres: només 2 llevats aïllats de 110 mostres, mentre que de les 21 mostres inicials havien aïllat les 6 soques de llevats esmentades. O sigui, que els llevats serien significativament més abundants en els recipients contenidors de begudes fermentades alcohòliques que en altres recipients arqueològics relacionats o els sediments al voltant.

Un altre argument que dóna suport a la hipòtesi dels autors d’aquest treball fou la identificació d’aquests 6 llevats. N’obtingueren el DNA total i procediren a la seqüenciació dels genomes i comparació amb les bases de dades. Dos d’ells, de l’època egípcia, foren identificats com Saccharomyces delphensis, una espècie que ha estat aïllada de figues seques africanes i que no és gens habitual en terra. Per tant, això suggereix la utilització de figues en les begudes alcohòliques d’aquests recipients. Un altre dels aïllats fou identificat com a Rhodotorula, que és un llevat contaminant freqüent en cerveses africanes. Un altre fou identificat com a Debaryomyces, llevats freqüents en cerveses tradicionals africanes de sorgo. Com he dit abans, un altre aïllat fou identificat com a Saccharomyces cerevisiae, el llevat més utilitzat per a fer vi, cervesa o pa (Figura 2). Malgrat això, la seqüència genètica d’aquest S. cerevisiae era clarament diferent de les soques més usades en l’actualitat, comercials o de laboratori, i per tant s’exclou la possibilitat d’una contaminació. I finalment, l’altre aïllat fou identificat com a Hypopichia burtonii, un llevat prèviament aïllat d’un hidromel d’Etiòpia.

Aquestes dades genètiques, junt amb la caracterització fenotípica (cinètica fermentativa i altres característiques bioquímiques) que Aouizerat et al (2019) van realitzar amb els aïllats, suggereixen que aquests llevats efectivament procedeixen d’un entorn relacionat amb les begudes alcohòliques. Fins i tot els autors van elaborar cervesa amb aquests aïllats i alguns, els Saccharomyces sobretot, van donar un resultat analític i sensorial força bo.

 

Fig 2 Saccharomyces_cerevisiae_SEM

Figura 2. Llevats Saccharomyces cerevisiae al microscopi electrònic de rastreig (MD Murtey & P Ramasamy)

 

Aouizerat et al (2019) conclouen que els aïllats són descendents dels llevats que foren utilitzats originalment en gran quantitat i en fermentacions repetides, i això hauria facilitat la seva supervivència en microambients dels porus de la matriu ceràmica d’aquests recipients, i que les microcolònies haurien seguit creixent mínimament durant mil·lennis gràcies a la humitat i nutrients residuals. Els autors fan l’analogia amb algunes cerveses artesanals on és usual que els residus dels recipients serveixin com a “estàrters” per a noves produccions.

Finalment, els autors d’aquest treball especulen que és possible aïllar microorganismes de restes arqueològiques, no només llevats, i que en el cas dels bacteris fins i tot podria ser més fàcil, donades les característiques de resistència d’alguns d’aquests, com els esporulats.

No hi ha cap treball similar previ al de Aouizerat et al (2019) ?

Com hem vist, és una troballa molt sorprenent, sens dubte. Científicament, el treball és força impecable i “aprovat” per la comunitat internacional: l’article és d’una revista d’accés obert amb prestigi (mBio, factor d’impacte 6.7), de l’American Society for Microbiology, on tots els articles són revisats per un mínim de dos experts, a banda dels editors. Els resultats que presenta l’article semblen molt ben treballats, i les conclusions estan ben raonades.

Tanmateix, per a mi segueix essent quasi increïble, i és estrany que no s’hagi trobat res semblant abans. Potser si algú altre prèviament hagués provat d’aïllar microorganismes tan antics i no se n’hagués sortit, potser no hauria publicat res i no ho sabríem ? Potser això no s’havia provat mai ? De fet, una explicació “malpensant” podria ser que els arqueòlegs tenen uns interessos i els microbiòlegs o biòlegs moleculars en tenen uns altres, i que per a aquest tipus de treball cal la col·laboració d’ambdós ?  Bé, no és ben bé així, ja que sí que hi han força treballs de microorganismes de l’antigor, però que sempre s’han enfocat a la detecció i anàlisi del DNA antic, amb la qual cosa es demostra que hi havien determinats microorganismes encara que no es procedís a aïllar-los o si més no a intentar-ho. 

Evidència de microorganismes en restes antigues gràcies al DNA

En relació als llevats, l’evidència més antiga és que se n’ha extret DNA ribosomal de Saccharomyces cerevisiae a partir de residus trobats dins gerres de vi d’Egipte de fa 5000 anys (Cavalieri et al 2003). Cal recordar que l’evidència arqueològica més antiga de producció de vi a gran escala és de fa 7400 anys al nord de les muntanyes Zagros, a l’actual Iran (McGovern et al 1986). Com sabeu, S. cerevisiae és també el llevat del pa i la cervesa, derivats dels cereals, però com que ni S. cerevisiae ni les seves espores són aèries, segurament la utilització d’aquest llevat en sucs fermentats del raïm, així com de dàtils, figues o mel, va precedir històricament el seu ús per a fer cervesa i pa (Cavalieri et al 2003). És probable que els llevats vínics que hi són de forma natural als raïms danyats (Mortimer & Polsinelli 1999) foren utilitzats per fermentar altres productes com els de cereals, i després de segles de selecció pels humans, evolucionessin en soques específiques per fermentar aliments i begudes.

Els genomes de microorganismes patògens també han estat estudiats en restes arqueològiques mitjançant les noves tècniques de seqüenciació massiva, per tal de seguir la pista a malalties infeccioses epidèmiques d’importància històrica, com la pesta negra, la tuberculosi, el còlera o la lepra (Andam et al 2016). En aquests casos lògicament les restes arqueològiques són restes humanes, com ossos, dents, copròlits o teixits momificats. D’aquesta manera per exemple, la filogènia i evolució de les soques del bacteri Yersinia pestis de la pesta negra ha pogut ser reconeguda des de restes de l’edat de Bronze (fa 5000 anys) fins les conegudes epidèmies dels segles 6è i 14è (Bos et al 2011). També és ben conegut el cas del genoma de Helicobacter pylori identificat a l’intestí de la mòmia d’Ötzi, l’home de gel dels Alps orientals, de fa 5300 anys (Maixner et al 2016).

També s’ha aïllat DNA de bacteris específics del digestiu humà, com Bifidobacterium i Bacteroides, per demostrar la presència humana en sediments arqueològics de fa 5000-12000 anys del nord est de Polònia (Madeja et al 2009).

Cal recordar que el DNA es degrada amb el temps, i de fet és més inestable que altres components cel·lulars. Aquesta macromolècula pateix espontàniament danys per oxidació, hidròlisi, i fragmentació en trossos que poden ser menors a 100 pb. La majoria de fòssils o altres restes biològiques de més d’uns 100.000 anys ja no contenen DNA amplificable (Hofreiter et al 2001), encara que sembla que si les mostres són extretes de sediments congelats, amb temperatures constants sota zero com els suara comentats, el DNA podria ser recuperat de fins a 400.000 anys o una mica més (Willerslev et al 2003). A més els teixits són colonitzats amb el temps per fongs i bacteris que redueixen en gran manera la quantitat relativa de molècules endògenes i poden contribuir a donar falsos positius. El risc de contaminació és molt alt i sovint aquesta es menysté. Generalment el DNA de l’hoste que s’analitza pot ser menys del 1% del DNA total trobat. Tots aquests factors compliquen l’extracció de DNA, la construcció de llibreries de seqüències, l’alineament de DNAs i l’anàlisi de genomes (Andam et al 2016).

Sorprenentment, hi ha uns quants treballs publicats on troben DNA antic de plantes, animals i diversos microorganimes, d’alguns milions d’anys (Ma), fins i tot centenars de Ma. Destaquen els obtinguts de mostres d’ambre de 20-40 Ma, i els obtinguts de sal de roca de 250 Ma (!!!!). Això seria comparable a la ficció del Parc Juràssic de recuperar DNA no degradat dels dinosaures d’uns 100 Ma.

Hebsgaard et al (2005) van revisar a fons tots aquests casos més espectaculars, amb la conclusió que aquests treballs pateixen de inadequats plantejaments experimentals i insuficient autentificació dels resultats. Per tant, hi ha grans dubtes de si les seqüències de DNA i en alguns casos els bacteris viables poden sobreviure aquests temps geològics tan grans.

A més, és preocupant que aquests treballs amb DNA tan antic no hagin estat replicats independentment per tal de confirmar la seva autenticitat, i que no mostressin una relació entre l’edat de la mostra i la persistència del DNA en funció dels diferents tipus de bacteris (Willerslev et al 2004). En canvi, aquests autors van estudiar la persistència del DNA al permafrost i com veiem (Figura 3) el DNA es va degradant i les quantitats són molt minses més enllà  de 100.000 anys i quasi no se’n troba passat 1 milió d’anys.

 

Fig 3 willerslev A

Figura 3. Persistència del DNA bacterià no degradat al llarg del temps (kyr, milers d’anys) mantingut al permafrost, mesurat per fluorescència (Willerslev et al 2004).

 

En analitzar els fílums bacterians d’aquests DNA, Willerslev et al (2004) observen (Figura 4) que els més persistents són els de Arthrobacter, principal representant dels Actinobacteris (gram-positius d’alt G+C), seguit dels esporulats (Bacillaceae i Clostridiaceae), i finalment els gram-negatius Proteobacteris.

 

Fig 4 willerslev D

Figura 4. Proporcions dels principals fílums bacterians (Actinobacteris en marron, Esporulats en taronja i Proteobacteris en blau) en base al DNA obtingut de mostres del permafrost, en funció del temps (kyr, milers d’anys) (Willerslev et al 2004).

 

Aquesta major persistència dels Actinobacteris no esporulats és sorprenent perquè els esporulats sempre han estat considerats com els més resistents de totes els tipus de cèl·lules. Malgrat que les endòspores tenen adaptacions especials com proteïnes que es lliguen al DNA per reduir la taxa de modificacions genètiques, no tenen metabolisme ni reparació activa i el seu DNA es degradarà amb el temps. Es desconeix el mecanisme de major resistència dels Actinobacteris, però podria haver-hi certa activitat i reparació del DNA a temperatures sota zero, i/o adaptacions relacionades amb l’estat de cèl·lules dorments (Willerslev et al 2004).

En qualsevol cas, els límits per amplificar el DNA per PCR estarien entre 400.000 anys i 1,5 Ma, per a mostres conservades sota zero, però això és molt més improbable en materials no congelats, com les mostres comentades d’ambre o sal de roca d’uns quants milions d’anys, i encara molt menys probable arribar a trobar cèl·lules viables d’aquestes mostres tan antigues (Willerslev et al 2004).

Bacteris “ressuscitats “

Alguns d’aquests mateixos treballs comentats on troben DNA d’alguns milions d’anys (Ma) són els casos més sorprenents d’haver “ressuscitat” microorganismes, bàsicament bacteris: cèl·lules viables de l’esporulat Bacillus de mostres d’ambre de 30 Ma (Cano & Borucki 1995), de Staphylococcus també d’ambre d’uns 30 Ma (Lambert et al 1998), i el cas més espectacular, de Bacillus d’una sal de roca de 250 Ma (Vreeland et al 2000). Aquest bacteri esporulat aïllat hauria estat en un ambient hipersalí del darrer Permià i atrapat a un cristall de sal, sobrevivint les espores fins a l’actualitat. Per al cas de Staphylococcus aïllat d’ambre, malgrat no ser esporulat, sembla que són bacteris molt resistents a condicions extremes, i que se n’han aïllat altres antics del permafrost i d’ambients molt secs (Lambert et al 1998). Malgrat això, la revisió de Hebsgaard et al (2005) d’aquests casos conclou que en cap d’ells es compleix el test de taxa relativa de distància molecular, on es calcula la taxa probable de mutacions en comparació a llinatges relacionats. Per tant, aquests aïllaments són discutibles i no reproduïts. A més, en el cas dels esmentats Bacillus de 250 Ma, s’ha discutit que la inclusió on eren els bacteris dins el cristall de roca podria ser resultat d’una recristal·lització posterior (Lowenstein et al 2011).

Una altra revisió sobre els rècords de preservació de microorganismes (Kennedy et al 1994) comenta casos publicats de fins a 600 Ma, senyalant que és curiós que hi ha força casos publicats de més de 1 Ma, i també de menys de 10000 anys, però en canvi hi ha molts pocs casos d’èpoques intermèdies. Aquests autors també remarquen els dubtes que plantegen els treballs amb bacteris supervivents tan antics, que segurament serien artefactes o contaminacions.

D’altra banda, més creïbles són els treballs de Abyzov et al (2006) i Soina et al (2004), que van demostrar la presència de diversos microorganismes vius, tant procariotes com eucariotes (llevats sobretot, però també algunes microalgues), en mostres del gel de l’Antàrtida que tenien alguns milers d’anys. Ho van fer mitjançant la combinació de mètodes microbiològics clàssics, com medis d’enriquiment i aïllament de colònies, junt amb microscòpia d’epifluorescència, microscòpia electrònica i tècniques moleculars i altres. Sembla que els bacteris que han trobat, gram-positius (Micrococcus) i gram-negatius (Arthrobacter), que no són esporulats, tenen cèl·lules dorments en forma de cist, que poden sobreviure mantenint la viabilitat a temperatures sota 0ºC durant alguns milers d’anys.

Tant quan es publiquen troballes de DNA geològicament antic com de cultius viables de mostres antigues, és fonamental la reproducció independent dels resultats per un altre laboratori, per excloure qualsevol contaminació del mateix laboratori. En el cas d’haver recuperat cèl·lules vives, cal demostrar la reproductibilitat de l’aïllament, seqüenciant els genomes dels cultius obtinguts en laboratoris independents a partir de la mateixa mostra, i comprovant que en ambdós casos els genomes coincideixen (Hebsgaard et al 2005).

A partir de les restes del fort romà de Vindolanda, al nord d’Anglaterra, s’han recuperat endòspores viables de Thermoactinomyces, un esporulat dels Bacillales (Unsworth et al 1977). Són de fa uns 1900 anys i les restes eren barreja d’argila amb palla i altres materials vegetals. Els autors proposen utilitzar aquests esporulats tan longeus com indicadors en estudis arqueològics.

A banda dels esporulats, hi ha uns quants grups de bacteris no esporulats per als quals s’han demostrat capacitats de resistència en anabiosi. En concret se n’han aïllat del permafrost i el sòl de la tundra de Sibèria del voltant del milió d’anys (Suzina et al 2006), al límit del que comentàvem abans (Willerslev et al 2004), força difícil de creure. Per estudiar experimentalment la formació d’aquestes formes d’anabiosi, Suzina et al van incubar diversos bacteris gram-positius, gram-negatius i algun arquea en medis pobres limitants en font de nitrogen, i després d’alguns mesos van obtenir-ne cèl·lules “dorments”. Van veure que aquestes tenen estructures de cist, amb càpsula i paret cel·lular engruixides, partícules intramembranoses i un nucleoide condensat (Figura 5). També van observar que aquests cists no tenen activitat metabòlica i aguanten factors estressants com la carència de nutrients o l’escalfament.

En estudiar els aïllats del permafrost, van confirmar que tenien estructures de cist molt semblants a les obtingudes al laboratori, amb estructures de paret multicapes de fins a 0,4 mm. De fet, aquests autors creuen que la majoria de bacteris presents al permafrost i a la tundra són en forma de cist (Suzina et al 2006).

 

Fig 5 fig2 modi Suzina

Figura 5. Seccions d’una cèl·lula vegetativa (a) de Micrococcus luteus i d’una cèl·lula cist (b) del mateix bacteri, obtinguda després de 9 mesos de cultiu en medi limitant en nitrogen. C, microcàpsula; CW, paret cel·lular; OL1, 2, 3, capes externes de la paret cel·lular; IL, capa interna de la paret; CM, membrana citoplasmàtica; N, nucleoide. La barra medeix 0.3 mm (Suzina et al 2006).

 

Altres llevats i fongs “ressuscitats”

A banda del sorprenent article de Aouizerat et al, motiu d’aquest post, hi han altres casos publicats de llevats i altres fongs “ressuscitats”, com els següents.

La chicha és com una cervesa de moresc, groguenca i una mica efervescent, elaborada i consumida per les poblacions andines des de fa alguns milers d’anys, el procés tradicional de la qual té la peculiaritat d’utilitzar l’amilasa de la saliva per convertir el midó en sucres fermentables. La fermentació tradicionalment tenia lloc en uns recipients d’argila anomenats “pondos”. Doncs a partir de les restes de pondos de la chicha de la cultura Hipia de Quito (fa 2100-2800 anys) s’han aïllat diversos tipus de llevats, sobretot Candida, Pichia i Cryptococcus (Gomes et al 2009). Curiosament, alguns d’aquests llevats s’han confirmat molecularment com Candida theae, similars a uns aïllats d’un té asiàtic contaminat (Chang et al 2012). Cal senyalar l’absència de Saccharomyces en aquestes chiches antigues, malgrat que en les actuals és un dels llevats principals, segurament provinent de les fermentacions de cervesa i vi que van portar els espanyols (Gomes et al 2009).

A partir de mostres de gel de Groenlàndia d’uns 100.000 anys (Ma et al 1999) sembla que també s’han pogut fer reviure diversos microorganismes, tant bacteris (Micrococcus, Rhodotorula, Sarcina) com llevats (Candida, Cryptococcus) i altres fongs (Penicillium, Aspergillus). Els autors també aïllen els DNAs i demostren el parentiu filogenètic dels aïllats. Un cop més, veiem com el gel proporciona un ambient estable i que facilita la conservació dels microorganismes i el seu DNA.

Raghukumar et al (2004) han recuperat viu el fong ascomicet esporulat Aspergillus i altres fongs a partir de mostres de sediments del fons marí, d’uns 5900 m de fons a la fossa de Chagos, al sud de les Maldives, a l’oceà Índic. En base a la fondària dins el sediment i els radiolaris presents, calculen que corresponen a un mínim d’uns 180.000 anys, i en alguns fins a 430.000 anys. A partir dels aïllats identificats com A. sydowii van obtenir espores que germinaven i creixien en pressió hidrostàtica equivalent a la fondària de 5000 m, i en una temperatura de 5ºC. Amb microscòpia d’epifluorescència i de camp brillant s’observen clarament les hifes del fong  i la seva relació amb les partícules del sediment (Figura 6). Sembla que la troballa d’aquests Aspergillus al fons marí és el fong més antic recuperat viu fins ara. Els autors suggereixen que la preservació hauria estat possible gràcies a l’elevada pressió hidrostàtica, junt amb la baixa temperatura.

 

Fig 6 Raghukumar Aspergillus deepsea indian

Figura 6. Fotomicrografies de sediment del fons (5900 m) de l’oceà Índic amb hifes de Aspergillus sydowii i partícules del sediment. (a) microscòpia d’epifluorescència combinada amb la de camp brillant; (b) epifluorescència (Raghukumar et al 2004).

 

Un dels treballs on es recuperen microorganismes viables més sorprenents i difícils de creure és el de Kochkina et al (2001), on aïllen un munt de fongs de tots els tipus, i bacteris, sobretot actinobacteris, a partir de mostres del permafrost de Rússia, Canadà i l’Antàrtida d’edats que arriben als 3 milions d’anys. Els autors suggereixen fins i tot que no hi ha un límit en quant a l’antiguitat possible per recuperar microorganismes viables. Aquest article ha tingut molt poc ressò, i ni tan sols és esmentat per articles posteriors com el de Raghukumar et al (2004).

Conclusions

Com hem vist, l’evidència de DNA de llevats no vius en restes antigues relacionades amb l’elaboració de vi es remunta a uns 5000 anys, a l’antic Egipte (Cavalieri et al 2003). Respecte a altres microorganismes, tenint en compte la degradació natural del DNA amb el temps, sembla que les mostres més antigues serien d’uns 400.000 anys com a molt, i en concret dels actinobacteris mantingudes en sediments congelats com el permafrost (Willerslev et al 2003). Les publicacions de recuperació de DNA de diversos bacteris de milions d’anys (fins a 600 Ma) presenten molts dubtes científics en quant a la seva versemblança i fiabilitat (Kennedy et al 1994).

En quant a llevats vius com els de 3000 anys de l’article motiu d’aquest post (Aouizerat et al 2019), sembla que llevats Candida i altres foren aïllats a partir de recipients per fer chicha d’uns 2800 anys (Gomes et al 2009), encara que aquesta referència és una revisió i el treball original no sembla haver estat publicat. Altres autors (Abyzov et al 2006; Soina et al 2004) també troben llevats vius, sense especificar quins, en mostres de gel de l’Antàrtida d’alguns milers d’anys. Més sorprenents són els aïllaments descrits de llevats i altres fongs i bacteris de mostres de gel de Groenlàndia de fa 100.000 anys (Ma et al 1999), així com els del fong Aspergillus del fons marí de l’Índic d’uns 180.000 anys (Raghukumar et al 2004).

En quant a altres microorganismes “ressuscitats”, alguns dels més fiables són els diversos bacteris del gel de l’Antàrtida d’alguns milers d’anys (Abyzov et al 2006) i les espores de Thermoactinomyces de restes romanes de 1900 anys (Unsworth et al 1977). Dels més antics, potser les formes d’anabiosi de bacteris conservades al permafrost de fa un milió d’anys (Suzina et al 2006) tindrien una certa versemblança. Curiosament, aquestes bacteris serien no esporulats però tindrien estructura de cist, amb paret multicapes i altres modificacions intracel·lulars. Les altres troballes de bacteris “ressuscitats” de més milions d’anys de l’ambre o de la sal de roca, de la mateixa manera que els seus DNA i també per això, són molt difícils de creure (Hebsgaard et al 2005).

Repensant en les formes cel·lulars de resistència i anabiosi, com les endòspores bacterianes i aquests cists suara comentats, cal recordar que els llevats, com molts altres fongs, tenen la capacitat de produir espores, en concret ascòspores ja que són ascomicets. Malgrat que aquestes tenen major capacitat de resistència que les cèl·lules vegetatives en ambients de sequedat o altres circumstàncies ambientals inhòspites i tenen una persistència en el temps, aparentment no hi ha (o no els he trobat) treballs relacionats amb la recuperació d’ascòspores de llevats a partir de mostres antigues.

El treball de Aouizerat et al (2019) no fa cap esment de les espores dels llevats, ni tan sols com a possible explicació de la supervivència d’aquests en aquestes mostres antigues. De fet, proposen que les microcolònies dels llevats als porus de la ceràmica durant aquests 3000 anys haurien seguit creixent mínimament gràcies a la humitat i nutrients residuals. Bé, no ho sabem, i tampoc si les ascòspores dels llevats hi han tingut algun paper.

Finalment, ens podem creure el que han trobat Aouizerat et al, però resta la porta oberta a investigar-ho en altres mostres arqueològiques similars, i no només pensant en cercar llevats vius, sinó també en bacteris d’altres productes fermentats, i més tenint en compte havent vist que no només els esporulats, sinó que altres podrien sobreviure, gràcies als cists o altres formes d’anabiosi no gaire conegudes com les dels actinobacteris.

 

Bibliografia

Abyzov SS et al (2006)Super-long anabiosis of ancient microorganisms in ice and terrestrial models for development of methods to search for life on Mars, Europa and other planetary bodies. Adv Space Res 38, 1191-1197

Andam CP et al (2016)Microbial genomics of ancient plagues and outbreaks. Trends Microbiol 24, 978 –990

Aouizerat T et al (2019)Isolation and characterization of live yeast cells from ancient vessels as a tool on bio-archaeology. mBio 10, 2, 1-21

Borschel-Dan A (2019)Israeli scientists brew groundbreaking “ancient beer” from 5,000-year-old yeast. The Times of Israel, 22nd may 2019.

Bos KI et al (2011)A draft genome of Yersinia pestisfrom victims of the Black Death. Nature 478, 506–510

Cano, R.J. and Borucki, M.K. (1995)Revival and identification of bacterial spores in 25- to 40-million year-old Dominican amber. Science 268, 1060–1064

Cavalieri D et al (2003)Evidence for S. cerevisiaefermentation in ancient wine. J Mol Evol 57:S226-232

Chang CF et al (2012)Candida theaesp. nov., a new anamorphic beverage-associated member of the Lodderomycesclade. Int J Food Microbiol 153, 10-14.

Gomes FCO et al (2009)Traditional foods and beverages from South America: microbial communities and production strategies. Chapter 3 in Industrial Fermentation, ed. J Krause & O Fleischer, Nova Science Publishers.

Hofreiter M et al (2001)Ancient DNA. Nature Rev Genet 2, 353–359.

Kennedy MJ et al (1994)Preservation records of micro-organisms: evidence of the tenacity of life. Microbiology 140, 2513-2529.

Kochkina GA et al (2001)Survival of micromycetes and actinobacteria under conditions of long-term natural cryopreservation. Microbiology 70, 356-364

Lambert LH et al (1998)Staphylococcus succinussp. nov., isolated from Dominican amber. Int J Syst Bacteriol 48, 511-518

Lowenstein TK et al (2011)Microbial communities in fluid inclusions and long-term survival in halite. GSA Today 21, 4-9

Ma L et al (1999)Revival and characterization of fungi from ancient polar ice. Mycologist 13, 70-73.

Madeja J et al (2009)Bacterial ancient DNA as an indicator of human presence in the past: its correlation with palynological and archaeological data. J Quaternary Sci 24, 317-321.

Maixner F et al. (2016)The 5300-year-old Helicobacter pylorigenome of the Iceman. Science 351, 162–165

McGovern PE et al (1986) Neolithic resinated wine. Nature 381:480–481

Mortimer R & M Polsinelli (1999)On the origins of wine yeast. Res Microbiol 150, 199-204

Raghukumar C et al (2004)Buried in time: culturable fungi in a deep-sea sediment core from the Chagos Trench, Indian Ocean. Deep Sea Res Part I: Oceanog Res Papers 51, 1759-1768

Soina VS et al (2004)The structure of resting microbial populations in soil and subsoil permafrost. Astrobiology 4 (3), 345–358.

Suzina et al (2006)The structural bases of long-term anabiosis in non-spore-forming bacteria. Adv Space Res 38, 1209-1219.

Unsworth BA et al (1977)The Longevity of ThermoactinomyceteEndospores in Natural Substrates. J Appl Microbiol 42, 45-52

Vreeland RH et al (2000)Isolation of a 250 milion-year-old halotolerant bacterium from a primary salt cristal. Nature 407, 897-900.

Willerslev E et al (2003)Diverse plant and animal DNA from Holocene and Pleistocene sedimentary records. Science 300, 791-795

Willerslev E et al (2004) Long-term persistence of bacterial DNA. Curr Biol 14,PR9-R10.

 

 

Els bacteris làctics de les cerveses: els dolents i els bons

18 agost 2018

Click here for the English version: The good and the bad lactic acid bacteria of beers

No és fàcil “viure” a la cervesa

En principi, la majoria de bacteris làctics (BL), i molts altres bacteris i en general molts microorganismes, no ho tenen fàcil per sobreviure dins la cervesa, ni a d’altres begudes alcohòliques com el vi. Com és conegut, això és un dels motius principals pel qual vins i cerveses hagin estat des de l’antigor una de les maneres més segures higiènicament de beure una cosa semblant a l’aigua i que no estigués contaminada, a banda de les aigües bullides, com el té i altres infusions d’herbes.

Els motius de la difícil supervivència dels microorganismes a la cervesa són l’etanol, el pH força àcid (al voltant de 4), l’escassesa de nutrients degut a què els llevats els han assimilat quasi tots, el poc oxigen dissolt, l’alta concentració de carbònic (un 0.5% en pes/volum) i la presència dels compostos derivats de la humulona (Figura 1) del llúpol: els iso-alfa-àcids, fins a 50 ppm, que són microbicides. Tots aquests obstacles fan molt difícil que qualsevol microorganisme hi pugui prosperar. Les cerveses més susceptibles de creixement microbià no desitjat són les que algun dels obstacles o impediments esmentats està esmorteït: cerveses amb pH més alt de 4.5, o amb poc etanol o poc CO2, o amb sucres afegits -que són nutrients-, o amb poca quantitat dels compostos derivats del llúpol (Vriesekoop et al 2012).

 

Fig 1 512px-S-Humulone_Isomerization.svg

Figura 1. La humulona (esquerra) del llúpol es degrada durant l’elaboració de la cervesa a isohumulona (dreta) i altres iso-alfa-àcids, compostos amargs característics i microbicides (Wikipedia; Sakamoto & Konings 2003)

 

El pH àcid de la cervesa (lleugerament superior al vi) inhibeix molts dels bacteris patògens més coneguts (Figura 2). I els casos que veiem que podrien créixer a aquest pH a prop de 4, són inhibits pels altres factors com l’etanol.

Fig 2 Menz 2009 jib49-fig-0002-m

Figura 2. Marges de pH àcid per al creixement de diversos bacteris, comparat amb el pH típic de les cerveses. Tret de Menz et al (2009).

 

Els bacteris làctics dolents a la cervesa

Malgrat el que acabem de veure, alguns bacteris -concretament alguns dels làctics- han estat capaços d’adaptar-se evolutivament a les condicions estrictes de les cerveses, i hi poden sobreviure i espatllar-les. En concret, les espècies més freqüents com perjudicials per a la qualitat de les cerveses són Lactobacillus brevis i Pediococcus damnosus (Figura 3). La primera és la més freqüent, i pot donar gustos i aromes no desitjats, així com terbolesa al producte final. P. damnosus té l’avantatge de créixer a baixes temperatures, i pot produir també aromes no volguts, destacant-ne el diacetil (Vriesekoop et al 2012). Alguns Pediococcus i Lactobacillus poden adherir-se als llevats, induint que sedimentin, la qual cosa retarda la fermentació (Suzuki 2011).

 

Fig 3 brevis i pedio

Figura 3. Lactobacillus brevis (esquerra) i Pediococcus damnosus (dreta) al microscopi electrònic de rastreig.

 

Alguns Pediococcus també poden ser els responsables de l’aparició d’amines biògenes en algunes cerveses, amb risc per al consumidor. Les amines en certa concentració són tòxiques, poden ser presents en alguns aliments fermentats com formatges, embotits i begudes alcohòliques com vins i cerveses, i es produeixen per descarboxilació d’aminoàcids per part dels BL. El nivell de tiramina i altres amines ha estat utilitzat com a mesura de la qualitat en algunes de les cerveses belgues elaborades amb BL (Loret et al 2005).

A banda d’aquests BL, altres bacteris relacionats amb problemes de contaminació a les cerveses són els acètics com Acetobacter, típicament associats amb l’entrada d’oxigen  a l’envasat o a la distribució. Altres bacteris perjudicials són alguns enterobacteris, com Shimwellia pseudoproteus o Citrobacter freundii, que proliferen a les primeres etapes de fermentació, i produeixen butanodiol, acetaldehid i altres compostos aromàtics no desitjats (Vriesekoop et al 2012). Uns altres bacteris perjudicials per a la cervesa, sobretot un cop embotellada, són Pectinatus i Megasphaera, que són anaerobis estrictes, de la família dels clostridis, i poden produir sulfur d’hidrogen i àcids grassos de cadena curta, tots ells desagradables (Suzuki 2011).

 

Els bacteris làctics bons de les cerveses

Els BL són ben coneguts per ser uns dels microbis que més beneficis aporten al camp alimentari, per una banda com a mitjà econòmic de conservar els aliments, i per altra banda per millorar-ne la qualitat i les característiques organolèptiques. Per això són els principals agents dels aliments fermentats, junt amb els llevats. Hem vist alguns dels beneficis alimentaris dels BL en altres posts d’aquest mateix blog: els formatges prehistòrics, o la microbiota de la llet materna, i fins i tot els bacteris del vi.

Així doncs, els BL també tenen el seu bon paper a la producció de les cerveses: en concret, com veurem tot seguit, en la producció de malt acidulat, i en alguns estils peculiars de cervesa com les Làmbic de Bèlgica i la Berliner Weissbier.

Com sabeu, el malt és la matèria primera per fer cerveses. El cereal és sotmès al procés del maltatge, on els grans del cereal -ordi fonamentalment- es fan germinar, els enzims hidrolitzen el midó a sucres, i tot plegat es cou a continuació, obtenint-ne el most, que és la solució substrat per tal que els llevats fermentin i produeixin l’etanol i el carbònic. L’acidificació del malt, o sigui amb un pH més baix, té els avantatges d’activar molts enzims importants al maltatge, i donar una menor viscositat al malt i per tant a la cervesa final. Encara que l’acidificació es pot aconseguir afegint-hi àcids minerals o l’àcid làctic comercial, sovint es recomana o es legisla que l’acidificació sigui biològica, la qual s’aconsegueix afegint-ne BL. La utilització de cultius iniciadors de BL és un procés relativament nou i a més dels beneficis comentats sobre la qualitat del malt, s’ha demostrat que també inhibeix floridures no desitjades que són un problema real al maltatge i que poden donar micotoxines. Els compostos produïts pels BL que poden inhibir els fongs són el mateix àcid làctic i la baixada de pH conseqüent, algunes bacteriocines, peròxid d’hidrogen, i altres compostos no gaire coneguts com potser alguns pèptids (Lowe & Arendt 2004).

Les soques de BL més utilitzades per acidular el malt són de Lactobacillus amylolyticus aïllats prèviament del mateix malt. Aquestes soques de L. amylolyticus són moderament termòfiles, resistents als compostos derivats de l’humulona, i tenen l’avantatge de ser amilolítics a banda de produir l’àcid làctic, que baixa el pH (Vriersekoop et al 2012).

Les cerveses en la fermentació de les quals intervenen BL, com les d’estils Làmbic i Berliner Weissbier, pertanyen al tipus de cerveses de fermentació espontània. Els altres tipus de cerveses de fermentació controlada són, com sabeu, les més conegudes Ale i les Lager, ambdues inoculades amb llevats específics. Les Ale són les de fermentació alta, on el llevat Saccharomyces cerevisiae utilitzat tendeix a romandre a la superfície i la temperatura de fermentació és per damunt de 15ºC i de 20ºC. Les Lager són les de fermentació baixa, originàries històricament de Baviera, on el llevat S. pastorianus (syn. S. carlsbergensis) tendeix a dipositar-se al fons del fermentador i la temperatura és entre 7 i 13ºC.

 

Les cerveses belgues Làmbic

Les cerveses belgues tradicionals d’estil Làmbic (neerlandès lambiek o lambik) són les més conegudes en quant a les seves característiques sensorials degudes a l’activitat dels BL. Són tradicionals de Brussel·les mateix i de la regió veïna de Pajottenland, a la vall de riu Zenne, al Brabant flamenc al SW de la capital belga. Un dels pobles d’aquesta vall és Lembeek, que podria ser l’origen del nom d’aquesta cervesa.

Aquestes cerveses flamenques de fermentació espontània representen l’estil més antic de fer cervesa del món desenvolupat, des de fa uns quants segles. Des de fa pocs anys se n’elaboren cerveses semblants a altres països en petites quantitats, i als EEUU des de 2008 se’n produeixen en força quantitat, les anomenades “American coolship ales” (Ray 2014).

Les cerveses làmbiques s’elaboren amb malta d’ordi i un mínim de 30% de blat no maltejat. Al most s’afegeixen els cons d’un llúpol especial, totalment assecats i envellits durant 3 anys. S’hi afegeixen no tant per al seu aroma o amargor, que justament els envellits en tenen menys, sinó com a antimicrobià, per prevenir sobretot el creixement de bacteris patògens gram-positius al brou de fermentació.

També per evitar aquests contaminants i per afavorir la microbiota pròpia de la fermentació làmbica, aquestes cerveses només es produeixen entre octubre i maig, ja que a l’estiu hi ha massa microorganismes perjudicials a l’aire que podrien espatllar la cervesa, i cal baixar la temperatura després de la bullida. L’ebullició del most es realitza de forma intensiva, amb una evaporació del 30%. Després de la bullida, el brou es deixa en dipòsits oberts, i d’aquesta manera hi són adquirits els microorganismes de l’aire presents a les sales de fermentació de la cerveseria, normalment a la part alta de l’edifici, i de l’aire exterior, ja que la tradició diu que cal deixar les finestres obertes. Se suposa que la microbiota captada és específica de la vall del Zenne. Aquests dipòsits oberts són els koelschip en neerlandès (coolship en anglès), com piscines (Figura 4). En ser ben oberts, amb molta superfície (uns 6 x 6 m) i poca fondària (uns 50 cm), afavoreixen la captació dels microbis de la sala i de l’exterior. Una altra finalitat d’aquesta forma és el refredament més ràpid del brou bullit per iniciar la fermentació. Poden ser de fusta, de coure o d’inoxidable més recentment.

DCIM100GOPROGOPR0641.JPG

Figura 4. Koelschip (en neerlandès) o coolship (en anglès), els dipòsits oberts, com piscines, on s’inicia el procés de la cervesa Làmbic (Brasserie Cantillon, Brussel·les).

 

El brou “inoculat” d’aquesta manera espontània només es deixa una nit als koelschip, i l’endemà aquest most ja es bombeja a tancs de fermentació on hi serà un any, on el contingut en sucres va baixant, fins a uns 30 g/L. Després es transfereix a barriques de roure de les utilitzades prèviament per a xerès o porto, on es pot arribar a deixar uns dos anys més, a unes temperatures de 15-25ºC. Algunes barriques fa 100 anys que s’utilitzen les mateixes. El producte final és una cervesa tèrbola, d’un groc pàl·lid, amb molt poc carbònic, seca, àcida, amb uns 6-8º d’etanol, que recorda una mica al xerès i sobretot a la sidra, i amb un regust lleugerament agre (Jackson 1999).

En aquest llarg procés de fermentació, fins a 3 anys, com és lògic, hi ha una diversitat en la composició de la població microbiana. En una primera fase hi ha una certa predominança de llevats Kloeckera i sobretot d’enterobacteris durant el primer mes. Al cap de 2 mesos ja predominen Pediococcus damnosus i Saccharomycess pp. i comença la fermentació alcohòlica. Després de 6 mesos de fermentació el llevat predominant és Dekkera bruxellensis (Spitaels et al 2014), o el que és el mateix, Brettanomyces (Kumara & Verachtert 1991), del qual Dekkera és la forma sexual.

Fig 5 Spitaels fig3

Figura 5. Espècies dels aïllats en medis d’agar MRS i VRBG, sobretot enterobacteris i bacteris làctics, al llarg del procés d’elaboració d’una cervesa làmbic. El nombre d’aïllats és entre parèntesis (Spitaels et al 2014).

 

Veiem (Figura 5) com en concret a partir dels 2 mesos el bacteri predominant és el bacteri làctic P. damnosus. Aquest fou nomenat als primers estudis com “P. cerevisiae“, però aquest nom finalment no fou admès perquè incloïa altres espècies. El recompte d’aquests en MRS és de 10UFC per mL fins al final de la fermentació. L’acidificació sembla que té lloc ràpidament en la transició de la primera fase a la de maduració, coincidint amb el creixement de P. damnosus, que produeix làctic, encara que Dekkera/Brettanomyces i els bacteris acètics també contribueixen a l’acidificació (Spitaels et al 2014).

En altres assajos amb les American coolship ales (ACA) d’estil làmbic també s’han trobat Lactobacillus spp., i en un estudi metagenòmic (Bukolich et al 2012) amb aquestes ACA s’ha detectat DNA de diversos lactobacil·lals, i al final del procés també s’observa un predomini de Pediococcus (Figura 6, panell C). A la mateixa figura al panell A observem com el fong unicel·lular predominant també és Dekkera/Brettanomyces.

Fig 6 Bukolich fig 2

Figura 6. Anàlisis TRFLP (polimorfismes de longituds de fragments de restricció terminal amplificats per PCR) de DNA total extret de mostres del procés de fermentació de cerveses ACA (similars a les làmbic) durant 3 anys, utilitzant encebadors específics per a: llevats (ITS1/ITS4 del 26S rDNA, panell A);  bacteris (16S rDNA, panell B); i bacteris làctics (panell C). Les mostres senyalades amb * no donaren amplificació. (Bukolich et al 2012)

 

Cerveses derivades de les Làmbic: Gueuze, les afruitades i altres

La làmbic bàsica, tal qual, és difícil d’aconseguir, només es troba a uns pocs cafès de Brussel·les i de la zona de producció. De fet, és la base per elaborar les altres, molt més habituals de consumir:

La Faro és una làmbic endolcida amb sucre moré i a vegades amb espècies.

Les làmbic afruitades són les que se’ls ha afegit fruites senceres o xarop de fruites. Poden ser amb cirera agre (kriek), que són les més tradicionals, o amb gerds, préssec, raïm, maduixa, i en ocasions també de poma o pinya o albercoc o altres.

I finalment, les Gueuze, que són escumoses i fàcils de trobar per al consumidor. S’elaboren barrejant làmbiques joves (de 6 mesos a 1 any) amb altres làmbiques més madures (de 2-3 anys) en ampolles de vidre gruixut semblants a les de xampany o cava i es deixen per a una segona fermentació gràcies als sucres romanents del làmbic jove. Això ho hauria començat a fer un alcalde de Lembeek cap al 1870, que era propietari d’una cerveseria i hi va aplicar les tècniques de fermentació en ampolla que feia alguns anys havien donat bon resultat a la Xampanya (Cervesa en català 2012). La paraula gueuze pot tenir el mateix origen etimològic que gist (llevat en neerlandès) i també podria referir-se a que produeix bombolles del carbònic, o sigui, gas (Jackson 1999). Tanmateix, una altra versió històrica seria que a aquesta cervesa li deien “Lambic de chez le gueux” (làmbic de cal pobre) perquè l’esmentat alcalde de Lembeek tenia idees socialistes semblants a les del “Parti des Gueus” (partit dels captaires) que van fundar els calvinistes de Flandes al segle XVI per lluitar contra l’imperi espanyol. I com que cervesa és femení en francès, el femení de gueux és gueuze, vet aquí (Cervesa en català 2012).

En aquesta refermentació en ampolla es mantenen les poblacions de Dekkera/Brettanomyces i de BL, encara que apareixen en poca quantitat altres fongs unicel·lulars com Candida, Hansenula, Pichia o Cryptococcus (Verachtert & Debourg 1999).

Fig 7 lambics3 swanbournecellars

Figura 7. Diverses cerveses Gueuze i làmbic afruitades, majoritàriament belgues (Foto de www.swanbournecellars.com.au/).

 

La Berliner Weissbier (Figura 8) és una altra cervesa relativament semblant a les Làmbic. També és una cervesa feta amb una part important de most de blat, és tèrbola, àcida i amb un 3% d’etanol. És una clàssica de Berlín i el nord d’Alemanya, elaborada des del s. XVI i que fins a finals del s. XIX era la beguda alcohòlica més popular de Berlín, i que els soldats de Napoleó anomenaven el “xampany del nord”. En la fermentació espontània del most intervenen una barreja de Dekkera/Brettanomyces, Saccharomyces i lactobacils heterofermentatius.

Fig 8 Berliner Weissbier boozedancing_Fotor

Figura 8. La cervesa Berliner Weisse (tret de G-LO, @boozedancing wordpress).

 

Cerveses tipus làmbic fetes a Espanya

De la mateixa manera que recentment es fan les comentades American Coolship Ales, també se’n fan a molts altres països i en el cas d’Espanya, coincidint amb el gust per les cerveses artesanals, també se n’elaboren de tipus làmbic, sobretot de les afruitades. Segons el portal Birrapedia, actualment se n’elaboren 6 d’aquestes, totes de cireres, de les quals dues a les terres de Lleida, una a Barcelona, una a la Marina Alta d’Alacant, una a la vall del Jerte, i una altra a Astúries.

 

Resistència dels bacteris làctics de la cervesa als compostos del llúpol

Lactobacils i pediococs, tant els dolents com els bons que hem vist, i altres bacteris contaminants de les cerveses, tenen la capacitat de resistir els compostos del llúpol, que com hem vist són microbicides naturals. Aquesta resistència pot ser deguda a diversos sistemes de defensa, tant actius com passius (Sakamoto & Konings 2003). Els actius inclouen bombes d’eflux, com HorA i HorC, que transporten els iso-alfa-àcids (Figura 1) cap a fora la cèl·lula.  HorA ho fa amb despesa d’ATP, i HorC mitjançant la força motriu de protons (Figura 9). Els gens corresponents horA i horC foren trobats originalment a L. brevis, però després s’han trobat també a L. lindneri, L. paracollinoides i el més conegut P. damnosus (Suzuki et al 2006).

Curiosament, HorA mostra una semblança del 54% amb OmrA, un transportador de membrana d’Oenococcus oeni, relacionat amb la tolerància d’aquest bacteri del vi a l’etanol i altres factors d’estrés (Bourdineaud et al 2004) (Vegeu alguna cosa més sobre O. oeni al meu post sobre els bacteris de la vinya i el vi). Per tant, és probable que HorA tingui també funcions d’exclusió d’altres compostos a banda dels del llúpol. S’ha vist que aquests gens de resistència horA i horC i les seves regions flanquejants estan molt ben conservades i tenen les seqüències quasi idèntiques a les diferents espècies que les tenen; per tant, és molt probable que unes les hagin adquirit de les altres mitjançant transferència gènica horitzontal, per plasmidis o transposons, com és usual en molts altres bacteris (Suzuki 2011).

Fig 9 brevis Suzuki fig 8

Figura 9. Mecanismes de resistència als compostos del llúpol (Hop) a Lactobacillus brevis (Suzuki 2011).

 

Com veiem a la mateixa Figura 9, els protons entrats són bombejats a fora per una ATPasa, i el consum d’ATPs és compensat formant-ne gràcies al consum de substrats com citrat, malat, piruvat o arginina. Un altre mecanisme de resistència, passiu en aquest cas, és la modificació de la composició d’àcids grassos de membrana, amb la incorporació de més saturats, com el C16:0, disminuint la fluïdesa de membrana i dificultant l’entrada dels compostos del llúpol. Això també ens recorda els canvis de membrana a O. oeni relacionats amb la resistència a etanol (Margalef-Català et al 2016). La paret cel·lular també canvia la seva composició en presència dels alfa-iso-àcids del llúpol, augmentant-ne la quantitat dels lipoteicoic d’alt pes molecular, la qual cosa també faria de barrera. Veiem també (Figura 9) com els compostos del llúpol poden fer disminuir els nivells intracel·lulars de Mn2+, i aleshores s’observa una major síntesi de proteïnes dependents de Mn i una major captació de Mn2+ de l’exterior. Finalment, les cèl·lules de L. brevis quan són a la cervesa redueixen la seva mida (Figura 10), probablement per disminuir la superfície extracel·lular, i així minimitzar l’efecte dels compostos tòxics externs (Suzuki 2011).

Fig 10 brevis mida Suzuki

Figura 10. Efectes de l’adaptació a la cervesa (esquerra) en la mida de les cèl·lules de Lactobacillus brevis en comparació a les crescudes en medi ric MRS (dreta). Les barres fan 5 µm (Suzuki 2011).

 

Tots aquests mecanismes s’han estudiat a soques de L. brevis perjudicials de la cervesa, però se suposa que la resistència que també tenen els bacteris beneficiosos de les làmbiques i altres ha de ser deguda als mateixos mecanismes, ja que són de les mateixes espècies bacterianes.

Com a conclusió de tot el que he comentat, veiem que els bacteris làctics tenen uns papers destacables com a beneficiosos en diversos aspectes de la cerveseria i malteria, malgrat el seu paper més conegut de perjudicials en l’elaboració de les cerveses més habituals.

 

Bibliografia

Birrapedia (vist 18 agost 2018) Cervezas de tipo Fruit Lambic elaboradas en España. https://birrapedia.com/cervezas/del-tipo-fruit-lambic-elaboradas-en-espana

Bokulich NA et al (2012) Brewhouse resident microbiota are responsible for multi-stage fermentation of American Coolship Ale. PLoS One, 7, e35507

Bourdineaud J et al (2004) A bacterial gene homologous to ABC transporters protect Oenococcus oenifrom ethanol and other stress factors in wine. Int J Food Microbiol 92, 1-14.

Cervesa en català (2012) Fitxes de degustació – Timmermans Gueuze Tradition http://cervesaencatala.blogspot.com.es/2012/06/fitxes-de-degustacio-timmermans-gueuze.html

Jackson, Michael (1999) Belgium’s great beers. Beer Hunter Online, july 30, 1999

Kumara HMCS & Verachtert H (1991) Identification of Lambic superattenuating micro-organisms by the use of selective antibiotics. J Inst Brew 97, 181-185

Loret S et al (2005) Levels of biogenic amines as a measure of the quality of the beer fermentation process: data from Belgian samples. Food Chem 89, 519-525

Lowe DP & Arendt EK (2004) The use and effects of lactic acid bacteria in malting and brewing with their relationships to antifungal activity, mycotoxins and gushing: a review. J Inst Brew 110, 163-180

Margalef-Català et al (2016) Protective role of glutathione addition against wine-related stress in Oenococcus oeni. Food Res Int 90, 8-15

Menz G et al (2009) Pathogens in beer, in Beer in Health and Disease Prevention, (Preedy, V. R. Ed.), 403–413, Academic Press, Amsterdam

Ray AL (2014) Coolships rising: the next frontier of sour beers in the U.S.  First we feast 27 feb 2014

Sakamoto K & Konings WN (2003) Beer spoilage bacteria and hop resistance. Int J Food Microbiol 89, 105-124

Spitaels F et al (2014) The microbial diversity of traditional spontaneously fermented lambic beer. PLOS One 9, 4, e95384

Suzuki K et al (2006) A review of hop resistance in beer spoilage lactic acid bacteria. J Inst Brew 112, 173-191

Suzuki K (2011) 125th Anniversary Review: microbiological instability of beer caused by spoilage bacteria. J Inst Brew 117, 131-155

The Beer Wench (2008) My obsession with wild beers. Nov. 20, 2008 https://thecolumbuswench.wordpress.com/tag/lambic/

Verachtert H & Debourg A (1999) The production of gueuze and related refreshing acid beers. Cerevisia, 20, 37–41

Vriesekoop F et al (2012) 125th Anniversary review: Bacteria in brewing: the good, the bad and the ugly. J Inst Brew 118, 335-345

 

Els bacteris de la vinya i del “terroir”, i presència d’Oenococcus als raïms del Priorat

Click here for the english version: Bacteria of vineyard and terroir, and presence of Oenococcus in Priorat (South Catalonia) grapes

22 abril 2015 

Els viticultors creuen que la terra en la qual creixen les vinyes dóna una qualitat única als seus vins, i d’això en diuen el terroir, o terrer si ho traduïm al català. Es pot considerar que la resposta fisiològica de les vinyes al tipus de sòl i les condicions climàtiques, juntament amb les característiques de la varietat i la forma de cultiu, donen lloc a unes propietats organolèptiques del vi que defineixen el seu terroir (Zarraonaindia et al 2015). Ara bé, no es coneix gaire si hi podria haver una microbiota específica de cada terroir, ja que aquest tema s’ha estudiat relativament poc.

Els microorganismes vínics als raïms ? Saccharomyces no hi és o no se’l troba

Els principals protagonistes de les fermentacions víniques, la alcohòlica (Saccharomyces cerevisiae) i la malolàctica (Oenococcus oeni) normalment no apareixen fins que el most està fermentant, ja doncs al celler. En condicions normals de raïms sans, pràcticament no es troba S. cerevisiae.

Oenococcus oeni als raïms ? Em sembla que nosaltres l’hem trobat !

En quant a O. oeni, fins ara s’ha publicat molt poc sobre la seva presència i aïllament en els raïms. En diversos treballs, com Sieiro et al (1990), o més recentment Bae et al (2006), ja havien aïllat alguns bacteris làctics de la superfície de raïms, però no O. oeni. Només Garijo et al (2011) van aconseguir aïllar una colònia (una només) d’O. oeni a partir de raïms de la Rioja. D’altra banda, s’ha detectat el DNA d’O. oeni en alguna mostra de raïms de Bordeus (Renouf et al 2005, Renouf et al 2007) per PCR-DGGE del gen rpoB, encara que no van aïllar cap bacteri d’aquesta espècie.

Em plau poder comentar que recentment al nostre grup hem aconseguit aïllar O. oeni dels raïms i tipificar-ne diverses soques, i justament estem elaborant una publicació al respecte (Franquès et al 2015). Efectivament, l’equip de recerca de bacteris làctics BL-URV, junt amb els companys de llevats del mateix grup de Biotecnologia Enològica (Facultat d’Enologia de la Universitat Rovira i Virgili a Tarragona) estem treballant en un projecte europeu, el “Wildwine” (FP7-SME-2012 -315065), que té per objectius analitzar els microorganismes autòctons (d’aquí lo de “wild”) del sistema vitivinícola del Priorat, i seleccionar-ne soques amb potencial enològic. Al projecte també hi participen la DOQ Priorat i el celler Ferrer-Bobet, així com grups de recerca i associacions de cellers de Bordeus, el Piemont i Grècia. En el marc d’aquest projecte vam prendre mostres de raïms (garnatxa i carinyena) de diverses finques del Priorat (Figura 1), així com també de vins realitzant la fermentació malolàctica, i en vam obtenir uns 1900 aïllats de bacteris làctics. Vam optimitzar l’aïllament a partir dels raïms a partir de la polpa i del most amb diversos mètodes d’enriquiment, i així vam obtenir uns 110 aïllats de raïms, identificats com O. oeni per tècniques moleculars específiques. Un cop tipificats, hem comprovat que els seus perfils moleculars no coincideixen amb soques comercials i per tant són autòctones. A més, alguns d’aquests aïllats dels raïms també els hem trobat als vins fets als cellers corresponents.

Fig 1 garna-cari Priorat

Figura 1. Prenent mostres de garnatxa (esquerra) i carinyena (dreta) de finques del Priorat per tal d’aïllar bacteris làctics com Oenococcus (Fotos Albert Bordons).


La microbiota dels raïms

Els raïms tenen una ecologia microbiana complexa que inclou llevats, fongs micelials i bacteris. Alguns només es troben als raïms, com els fongs paràsits i els bacteris ambientals, i altres tenen la capacitat de sobreviure i créixer als vins: sobretot llevats, bacteris làctics i bacteris acètics. La proporció de tots plegats depèn de l’estat de maduració del raïm i de la disponibilitat de nutrients.

Quan els fruits són intactes, la microbiota predominant són els llevats basidiomicets com Cryptococcus i Rhodotorula, però quan són més madurs, comencen a tenir microfisures que faciliten la disponibilitat de nutrients i expliquen la predominança just abans de la verema d’ascomicets lleugerament fermentatius com Candida, Hanseniaspora, Metschnikowia i Pichia. Quan la pell ja està més danyada poden aparèixer llevats perjudicials com Zygosaccharomyces i Torulaspora, i bacteris acètics. Entre els fongs filamentosos poden haver-hi ocasionalment alguns molt perjudicials com Botrytis (la podridura) o Aspergillus productors d’ocratoxina, que encara que només són actius a la vinya, els seus productes poden afectar la qualitat del vi.

D’altra banda, a la superfície dels raïms s’han aïllat bacteris ubics ambientalment com diversos enterobacteris, Bacillus, i estafilococs, però cap d’ells pot créixer al vi (Barata et al 2012).

Tornant a la possible microbiota específica del terroir, s’ha vist que alguns compostos volàtils que contribueixen a l’aroma del vi, com 2-metil-butanoic o 3-metil-butanol, són produïts per microorganismes aïllats a les vinyes, com el bacteri grampositiu Paenibacillus, o el fong basidiomicet Sporobolomyces o l’ascomicet Aureobasidium. Per tant, podria haver una relació entre algunes de les espècies microbianes trobades a la vinya i alguns aromes detectats al vi, procedents del most, és clar (Verginer et al 2010).

La metagenòmica com a eina analítica de la microbiota dels raïms

Donat que els mètodes clàssics d’aïllament i cultiu dels microorganismes són lents, laboriosos i alguns dels microbis no s’aconsegueix fer-los créixer en els medis d’aïllament, actualment es recorre als mètodes de seqüenciació massiva o metagenòmica. Aquests consisteixen en analitzar el DNA present i a partir de les seqüències, deduir amb les bases de dades quins són els microorganismes presents a la mostra. En el cas dels bacteris sovint s’utilitza el DNA amplificat del fragment V4 del gen 16S RNA (Caporaso et al 2012).

S’ha utilitzat en mostres de vins botrititzats (Bokulich et al 2012) i s’han trobat proporcions de diversos bacteris làctics (però no Oenococcus), inclosos alguns no associats normalment a vi. També s’ha utilitzat per veure la microbiota resident als cellers i com canvia segons les estacions, comprovant que a les superfícies dels dipòsits i maquinària del celler hi ha una majoria de microorganismes no relacionats amb el vi ni tampoc perjudicials (Bokulich 2013).

Amb aquesta tècnica Bokulich et al (2014) també han analitzat els raïms i han vist diferències clares entre les proporcions dels diversos grups bacterians (i de fongs) entre diferents llocs, diferents varietats, i també segons les condicions ambientals o biogeogràfiques. Per exemple, en analitzar 273 mostres de mostos de raïms de Califòrnia, les 3 varietats (Cabernet, Chardonnay i Zinfandel) queden bastant discriminades en una anàlisi de components principals respecte a les comunitats bacterianes trobades a cada mostra (Figura 2).

Així doncs, els grups o taxons bacterians dominants en una varietat o ambient determinat podrien aportar unes característiques específiques en aquells vins, i això podria explicar alguns patrons regionals o de terroir en les propietats organolèptiques d’aquests vins (Bokulich et al 2014).

Fig 2 ACP Bokulich 2014

Figura 2. Anàlisi de components principals de les comunitats bacterianes de mostres de mostos de raïms de Sonoma (Califòrnia) de 3 varietats diferents (Cabernet en vermell, Chardonnay en verd i Zinfandel en blau) (Bokulich et al 2014).


Nosaltres també hem realitzat un estudi de seqüenciació massiva amb les mostres de raïms de les quals hem obtingut aïllats d’O. oeni, com he comentat abans (Franquès et al 2015), i en més 600.000 seqüències del rRNA 16S analitzades hem trobat sobretot Proteobacteris i Firmicutes. Entre aquests grampositius, hem trobat seqüències de bacteris làctics (un 15%) i d’aquests hem pogut confirmar amb èxit la presència d’O. oeni en un 5% de les seqüències. Per tant, hem aïllat O. oeni dels raïms i n’hem detectat el seu DNA en força mostres.

La microbiota bacteriana de tota la vinya i del sòl

Com veiem, s’ha estudiat una mica la microbiota dels raïms i dels vins, però molt menys la microbiota dels sòls, la qual pot definir més bé el terroir, que està influït pel clima local i les característiques de la vinya.

Veiem a la Figura 3 un resum dels principals gèneres trobats a les diferents parts de la vinya i al sòl (Gilbert et al 2014).

Fig 3 Gilbert 2014

Figura 3. Principals bacteris i fongs associats als òrgans i sòl de Vitis vinifera (Gilbert et al 2014)


Recentment s’ha publicat un treball interessant (Zarraonaindia et al 2015) sobre aquest tema, amb l’objectiu de veure si el sòl podria ser la principal font de bacteris que colonitzen els raïms. Han agafat mostres de sòl, arrels, fulles, raïms i flors de Merlot, de diferents terrenys i anys, de Suffolk, Nova York, i n’han analitzat el DNA dels bacteris presents mitjançant seqüenciació del 16S rRNA. Han trobat que un 40% de les espècies trobades són presents a totes les mostres de sòls i arrels, mentre que en fulles i fruits hi ha més variabilitat, i a més un 40% de les trobades en fulles i fruits també apareixen a les mostres de sòls. Tot plegat suggereix que molts dels bacteris s’originen al sòl.

En quant als tipus de bacteris presents, com veiem (Figura 4), predominen els Proteobacteris (sobretot Pseudomonas i Methylobacterium), principalment a les parts aèries de la planta. També hi han Firmicutes lògicament, i Acidobacteria i Bacteroides.

Fig 4 microbiota vineyard

Figura 4. Composició de la comunitat bacteriana, a nivell taxonómic de fílum, en mostres de diferents òrgans de la vinya i el seu sòl (Zarraonaindia et al 2015).


Encara que s’observen variacions en totes les mostres en funció de l’any (poden tenir diferents condicions climàtiques) i en funció de factors edàfics diferents (pH, C:N, humitat), com veiem (Figura 5) les anàlisis de components principals demostren que els tipus de mostres (sòl, arrels, fulles, raïms) es diferencien força bé, i mostres de mostos abans de fermentar queden semblants a les de raïms.

Fig 5 distribució grups mostres OTUs

Figura 5. Anàlisi de components principals mostrant les semblances en quant a la composició dels grups taxonòmics presents, entre tots els tipus de mostres, incloent-ne de mostos (Zarraonaindia et al 2015).


Això suggereix que la comunitat bacteriana present als raïms roman relativament estable fins al most, i si més no, més estable que les diferències entre òrgans. Al mateix temps, una part important dels representants dels fílums bacterians dels raïms vindrien del sòl. Això es pot explicar perquè en fer la verema manual els raïms sovint són situats en caixes que es deixen a terra, o bé si es fa verema mecànica, la maquinària utilitzada remou el terra i genera pols, que pot colonitzar els raïms.

Per tant, la microbiota del sòl és una font de bacteris associats a la vinya i pot tenir un paper en el most, i per tant en la vinificació, i potencialment en la formació de les característiques del terroir. Alguns d’aquest bacteris poden tenir papers no coneguts de productivitat o de resistència a malalties de la planta, o contribuir a les característiques organolèptiques del vi (Zarraonaindia et al 2015).

A banda d’això, i pensant en els microorganismes vínics, responsables de les fermentacions, com he comentat, al nostre laboratori hem pogut confirmar que als raïms hi ha algunes soques d’Oenococcus oeni i ho hem corroborat amb la detecció del seu DNA als mateixos raïms.


Bibliografia

Bae S, Fleet GH, Heard GM (2006) Lactic acid bacteria associated with wine grapes from several Australian vineyards. J Appl Microbiol 100, 712-727

Barata A, Malfeito-Ferreira M, Loureiro V (2012) The microbial ecology of wine grapes (Review). Int J Food Microbiol 153, 243-259

Bokulich NA, Joseph CML, Allen G, Benson AK, Mills DA (2012) Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine. Plos One 7, e36357

Bokulich NA, Ohta M, Richardson PM, Mills DA (2013) Monitoring seasonal changes in winery-resident microbiota. Plos One 8, e66437

Bokulich NA, Thorngate JH, Richardson PM, Mills DA (2014) Microbial biogeography of wine grapes is conditioned by cultivar, vintage, and climate. PNAS nov 25, E139-E148

Caporaso JG, Lauber CL, Walters WA, Berg-Lyons D, Huntley J, Fierer N, Owens SM, Betley J, Fraser L, Bauer M, Gormley N, Gilbert JA, Smith G, Knight R (2012) Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J 6, 1621–1624

Franquès J, Araque I, Portillo C, Reguant C, Bordons A (2015) Presence of autochthonous Oenococcus oeni in grapes and wines of Priorat in South Catalonia. Article en elaboració.

Garijo P, Lçopez R, Santamaría P, Ocón E, Olarte C, Sanz S, Gutiérrez AR (2011) Eur Food Res Technol 233, 359-365

Gilbert JA, van der Lelie D, Zarraonaindia I (2014) Microbial terroir for wine grapes. PNAS 111, 5-6

Renouf V, Claisse O, Lonvaud-Funel A (2005) Understanding the microbial ecosystem on the grape berry surface through numeration and identification of yeast and bacteria. Aust J Grape Wine Res 11, 316-327

Renouf V, Claisse O, Lonvaud-Funel A (2007) Inventory and monitoring of wine microbial consortia. Appl Microbiol Biotechnol 75, 149-164

Sieiro C, Cansado J, Agrelo D, Velázquez JB, Villa TG (1990) Isolation and enological characterization of malolactic bacteria from the vineyards of Northwestern Spain. Appl Environ Microbiol 56, 2936-2938

Verginer M, Leitner E, Berg G (2010) Production pf volatile metabolites by grape-associated microorganisms. J Agric Food Chem 58, 8344-8350

Sorprenent: bacteris de l’acne humana a la vinya !!

Click here for the english version: Surprising: bacteria of human acne passed to the vineyard !! 

3 juny 2014

Realment sorprenent, però això sembla: uns investigadors italians i austríacs han publicat un treball (Campisano et al. 2014) on demostren que bacteris de l’espècie Propionibacterium acnes, relacionada amb l’acne humana, es troben com a endòfits obligats als teixits de l’escorça de Vitis vinifera, la vinya.

Alguns bacteris patògens dels humans, com Salmonella, són capaços de colonitzar teixits vegetals però de forma oportunista i temporalment (Tyler & Triplett 2008). De fet, hi ha un benefici mutu temporal entre plantes i bacteris, de manera que alguns d’aquests enterobacteris no patògens per a les plantes hi viuen endofíticament i poden ser beneficioses per a elles. Aquests patògens per als humans, en el seu cicle biològic utilitzen les plantes com a hostes alternatius per sobreviure al medi ambient, passant-hi mitjançant aigües de regadiu contaminades. Per tant, alguns bacteris sovint són hostes endòfits temporals de les plantes.

Però d’altra banda, són relativament rars els casos de bacteris que canviïn d’hoste i acabin adaptant-se al nou hoste, essent finalment endòfits fixos. Aquesta transferència horitzontal passa sobretot entre hostes propers evolutivament, com bacteris simbiòtics d’insectes àfids que s’ha demostrat que han passat a altres espècies d’àfids (Russell & Moran 2005). També s’ha suggerit la transferència horitzontal en bacteris làctics beneficiosos del tracte intestinal de vertebrats com Lactobacillus reuteri, del qual es troben soques semblants en diverses espècies de mamífers i aus.

Doncs bé, anant més enllà, en el treball de Campisano et al. objecte d’aquest comentari, es conclou que un tipus d’aquests bacteris relacionats amb l’acne humana haurien passat a la vinya, o sigui, els bacteris haurien fet una transferència horitzontal interregne, des d’animals mamífers a plantes.

 

Propionibacterium acnes tipus Zappae

L’acne, com sabeu, és una afecció humana consistent en un excès de secreció de les glàndules pilosebàcies de la pell causada per canvis hormonals, sobretot als adolescents. Les glàndules s’acaben inflamant, obstruint-se els porus i apareixent erupcions cutànies. El microorganisme associat a aquestes infeccions és el bacteri oportunista comensal P. acnes, bacil grampositiu anaeròbic aerotolerant, que s’alimenta dels àcids grassos del sèu produït per les glàndules.

fig1 Akne-jugend

Jove amb acne (Wikimedia, públic)

fig2

Propionibacterium acnes al microscopi electrònic de rastreig (esquerra) i tenyit amb cristall violeta (dreta). Tret de Abate ME (2013) Student Pulse 5, 9, 1-4.

 

Curiosament, altres espècies del mateix gènere Propionibacterium molt conegudes en biotecnologia microbiana industrial són les utilitzades per a la producció d’àcid propiònic, vitamina B12, i els formatges suïssos tipus Emmental o Gruyère.

Campisano et al. han fet un estudi de l’endomicrobioma de la vinya mitjançant la tècnica de seqüenciació (Roche 454) amplificant la regió hipervariable V5-V9 dels rDNA 16S bacterians presents als teixits vegetals de la planta. En 54 de les 60 plantes analitzades, entre un 0,5% i un 5% de les seqüències trobades corresponen a bacteris de l’espècie Propionibacterium acnes. Això ho han confirmat per observacions d’hibridació fluorescent in situ (FISH) amb fluorcroms i sondes específiques de P. acnes.

fig 3 FISH P acnes escorça vinya

Localització de P. acnes (taques blavoses fluorescents) a l’escorça d’una tija de vinya mitjançant microscòpia FISH amb sondes específiques d’aquest bacteri (Campisano et al 2004).

 

Els autors d’aquest treball proposen per a aquest bacteri trobat el nom de P. acnes Zappae, recordant l’excèntric músic i compositor Frak Zappa, per subratllar l’inesperat i gens convencional hàbitat d’aquest tipus de P. acnes.

 

fig 4 Frank Zappa

Frank Zappa (1940-1993), l’excèntric i satíric cantant, guitarrista i compositor. Foto: Frank Zappa reviews.

 

 

I cóm va passar aquest bacteri d’origen humà a la vinya ?

Per resoldre aquest enigma, Campisano et al. han agafat les seqüències 16S rDNA i d’altres gens (recA i tly), dels P. acnes Zappae que han trobat i les han comparat amb les dels P. acnes d’origen humà de les bases de dades. Comparant les filogènies i els clusters que es dedueixen, han arribat a concloure que P. a. Zappae s’ha diversificat evolutivament dels altres molt recentment. Estudiant-ne en detall les seqüències del gen recA de P. a. Zappae, i tenint en compte la seva taxa de mutació probable i el seu temps de generació (unes 5 h), dedueixen que la diversificació respecte als altres P. acnes es va produir fa uns 6000-7000 anys.

Aquesta data coincideix amb la domesticació coneguda de la vinya pels humans, que es creu que va tenir lloc fa uns 7000 anys a la regió meridional del Caucas, entre el mar Negre i el Caspi, entre les actuals Turquia, Georgia, Armenia i Iran (Berkowitz 1996). La vinya té l’origen en una subespècie silvestre de Vitis que va sobreviure l’Era glacial i va ser domesticada. De la planta originària en sortiren tres subespècies, i una d’elles, Vitis vinifera pontica,a la zona esmentada i més al sud a Mesopotàmia s’acabaria escampant per Europa gràcies alsfenicis.

Per tant, la conclusió és que P. a. Zappae es va originar a partir del P. acnes humà fa uns 7000 anys, pel contacte de les mans humanes amb els raïms i altres parts de la vinya en veremar-la i traginar-la. Tal com diuen els autors, aquest cas seria la primera evidència de transferència horitzontal interregne, des dels humans a les plantes, d’un bacteri simbiont obligat. A més, això fa més remarcable l’extrema adaptabilitat dels bacteris i que llur capacitat d’explotar nous hàbitats pot tenir impactes imprevistos en l’evolució de la relació hoste-simbiont o fins i tot hoste-patogen.

fig 5 m_so_america_hands_close

 Veremant a mà a Xile (Fine Wine and Good Spirits)

 

 

Bibliografia

Berkowitz M (1996) World’s earliest wine. Archaeology 49, 5, sept/oct.

Campisano Aet al. (2014) Interkingdom transfer of the acne-causing agent, Propionibacterium acnes, from human to grapevine. Mol Biol Evol 31, 1059-1065.

Gruber K (4 march 2014) How grapevines got acne bacteria. Nature News 4 march 2014.

Russell JA, NA Moran (2005) Horizontal transfer of bacterial symbionts: heritability and fitness effects in a novel aphid host. Appl Environ Microbiol 71, 7987-7994.

Tyler HL, EW Triplett (2008) Plants as a habitat for beneficial and/or human pathogenic bacteria. Ann Rev Phytopathol 46, 53-73.

Wikipedia, per descomptat: Propionibacterium acnes, Vitis, …

Walter J, RA Britton, S Roos (2011) PNAS 108, 4645-4652.

1ª Jornada de Recerca en Enologia i Viticultura a Catalunya

Click here for the english version: 1st Conference of Research on Oenology and Viticulture in Catalonia

24 gener 2013

Abans que res, demano disculpes als amics d’aquest blog pels quasi 5 mesos darrers sense publicar-hi res. Ho sento, se m’havia acumulat la feina de docència i recerca, i també per la preparació d’aquesta Jornada que ara comento.

imatge Jornada

El passat 4 de juny s’ha celebrat a Tarragona la 1ª Jornada de Recerca en Enologia i Viticultura a Catalunya. He tingut el plaer d’haver-ne estat l’organitzador, juntament amb en Pep Llauradó, perquè sóc el coordinador (i en Pep el gestor) del subcampus Enologia del CEICS, o sigui, el Campus d’Excel·lència Internacional de Catalunya Sud.

El CEICS és l’agregació estratègica, impulsada per la Universitat Rovira i Virgili, de les diferents entitats i estructures de docència, recerca, transferència de coneixement i el sector productiu del sud de Catalunya, amb l’objectiu d’esdevenir un referent internacional en 5 àmbits: Química, Nutrició-Salut, Turisme, Patrimoni-Cultura i Enologia.

L’any passat 2012 vaig tenir l’honor de ser nomenat coordinador del subcampus Enologia del CEICS, pel rector de la URV Xavier Grau, que és el president del CEICS.

logo CEICS Eno

El subcampus d’Enologia aplega la URV, la Fundació URV, el parc tecnològic de Falset VITEC, l’IRTA, l’INCAVI, el clúster INNOVI, així com la majoria de D.O. catalanes, sobretot les de les comarques tarragonines, i també empreses i cellers com Freixenet i altres.

Un dels objectius principals del CEICS és promoure la visibilitat de la recerca que es fa al territori. Per això, ja des dels inicis del CEICS, amb motiu del 1r Fòrum que tingué lloc el novembre del 2011, es va pensar en fer una Jornada com aquesta en l’àmbit català de recerca vitivinícola.

foto Jornada

Inauguració de la Jornada, amb el rector de la URV Xavier Grau i el degà de la Facultat d’Enologia Joan Miquel Canals

A Catalunya sovint tenim l’oportunitat d’assistir a diverses jornades científiques o tècniques d’enologia i/o viticultura. L’INCAVI, l’Associació Catalana d’Enòlegs (ACE) o el clúster INNOVI, o la mateixa Facultat d’Enologia de la URV sovint organitzen jornades tècniques o cursos específics. Totes elles són molt necessàries i interessants, i aporten valor afegit al sector vitivinícola català, però tanmateix potser no s’havia fet fins ara cap trobada de tots els investigadors d’aquest àmbit a nivell català, per visualitzar globalment tota la recerca que s’està duent a terme, no només en un tema o enfoc específic.

retol Jornada 3

Per tot plegat, vam considerar oportú aprofitar l’empenta del CEICS per a organitzar aquesta Jornada a nivell català. L’objectiu principal era fer conèixer i difondre la recerca que es fa a Catalunya en Enologia i Viticultura i aspectes relacionats. En repassar les bases de dades de publicacions científiques dels darrers anys abans de la Jornada, hem pogut constatar que al país hi ha uns 20 grups d’investigadors que tenen com a línies de recerca principals les relacionades amb les ciències de la vinya i el vi, però a més a més hi ha uns altres 40 grups o investigadors que encara que el seu àmbit principal de recerca no sigui la viticultura o l’enologia, han publicat aquests darrers anys diversos treballs relacionats en diferents aspectes, fins i tot de disciplines científiques aparentment allunyades. Tots ells van ser convidats a la Jornada celebrada a Tarragona, en concret al Campus Sescelades de la URV, per presentar els seus treballs més innovadors o les línies de recerca, en forma de pòsters. Cal agrair-los a tots la molt bona resposta que hi va haver, amb un total de 44 pòsters presentats.

IMG_0055IMG_0089IMG_0164

Un altre objectiu implícit de la Jornada era la trobada. Aquesta Jornada ha estat una ocasió per trobar-se, descobrir i comentar els detalls dels darrers treballs amb els companys dels diferents centres catalans, potser fins i tot conèixer-se per primer cop personalment en alguns casos, i promoure les col·laboracions entre els diferents grups.

IMG_0127

IMG_0046

Però a més aquesta Jornada no ha estat una trobada exclusiva per als científics. La recerca no té sentit si no té una aplicació pràctica i uns beneficis en els processos vitivinícoles, encara que sovint l’aplicació no sigui immediata. Això lliga amb l’objectiu principal de la Jornada, ja comentat, de fer visible la recerca que es fa aquí. En aquest sentit, alguns dels pòsters que s’han presentat han estat seleccionats per tal que els mateixos autors els comentessin breument en les sessions generals, i la selecció ha estat realitzada tenint en compte l’interès de la recerca feta per al sector vitivinícola.

La majoria del programa de la Jornada estava relacionada amb els mateixos pòsters presentats. Per això, a més de poder veure’ls i comentar-los particularment amb els autors al llarg del dia, hi va haver 4 sessions generals on els experts moderadors ens els van presentar de forma resumida. En aquestes 4 sessions es van agrupar els diversos pòsters en base als seus àmbits.

IMG_0199IMG_0058Els moderadors Robert Savé (IRTA), Anna Puig (INCAVI) i a baix, el sociòleg i escriptor Lluís Tolosa prenent anotacions d’un dels pòsters

IMG_0113

En Robert Savé de l’IRTA va presentar i moderar els de Viticultura. L’Olga Busto de la URV ho va fer amb els de Química i Tecnologia en Enologia. L’Anna Puig ho va fer amb els de Microbiologia en Enologia i Viticultura, i finalment el sociòleg i escriptor Lluís Tolosa ho va fer amb els d’altres àmbits relacionats amb la vinya i el vi, com els efectes sobre la salut, els temes de medi ambient, o altres aspectes socioeconòmics com el turisme, o aplicacions a altres indústries alimentàries, i també aspectes culturals o històrics i fins i tot prehistòrics.

El conjunt de comunicacions presentades ha demostrat el bon nivell internacional de qualitat de la recerca efectuada en enologia i viticultura a Catalunya, i al mateix temps la gran diversitat de temes. Amb els resums de les comunicacions s’ha editat un llibre (1ª Jornada de Recerca en Enologia i Viticultura a Catalunya, Llibre de resums de la Jornada organitzada pel CEICS, Tarragona 4 juny 2013), que ha estat publicat pel Servei de Publicacions de la URV, amb el ISBN 978-84-695-7878-0.

A més, la Jornada ha comptat amb la conferència inaugural d’un investigador de prestigi internacional en genètica de la vinya, en José Miguel Martínez Zapater, que té un ampli currículum investigador en genètica de plantes.

foto JM Mz Zapater

Des del 1998 el Dr. Zapater treballa en la genètica de Vitis, havent assolit importants resultats, tant a nivell d’identificació de varietals per tècniques moleculars, com en transcriptòmica de la vinya, amb l’estudi de l’expressió gènica en funció de les condicions de canvi climàtic. Des del 2010 és el director del nou Instituto de Ciencias de la Vid y el Vino (ICVV) a Logroño.

IMG_0022

La conferència del Dr. Zapater va ser una excel·lent revisió sobre les bases genètiques de la variabilitat de Vitis i de les tècniques moleculars per identificar les diferents varietats.

Podem dir que la Jornada, amb uns 70 assistents, ha estat un èxit. Hi han assistit  investigadors, estudiants, tècnics i professionals, de la URV, INCAVI, IRTA, VITEC, UAB, UB, UPC, UdL, CSIC, i de 7 empreses o cellers. En una enquesta que se’ls ha fet, la gran majoria dels assistents han estat molt satisfets de la Jornada, la seva organització, el seu desenvolupament, i desitgen que es torni a fer, i també que s’estableixi amb una periodicitat anual o bianual.

jornada + logo ceics

Canvi climàtic i vi: finalització del projecte CENIT DEMÉTER

3 desembre 2012

El passat 15 de novembre se celebrà a Madrid, a la seu central del CSIC, la jornada de Clausura del projecte CENIT DEMÉTER sobre la influència del canvi climàtic en la viticultura i enologia, projecte en el qual he tingut el plaer de participar.

Assistents a Jornada Clausura Demeter

Representants d’empreses i dels grups de recerca juntament amb personal del CDTI a la Jornada de Clausura del projecte CENIT DEMÉTER al CSIC de Madrid, 15 novembre 2012. Foto de Procrea.

Efectes del canvi climàtic sobre la viticultura i la vinificació

Malgrat que encara hi ha gent que ho posa en dubte, el canvi climàtic a la Terra és científicament evident. Com veiem a la Figura d’aquí sota, si es consideren els darrers 150 anys, l’augment de la temperatura global ha estat de 0,05ºC cada 10 anys, però si es consideren només els darrers 25 anys, l’augment ha estat de 0,18ºC cada 10 anys: Per tant, la tendència és clara cap a augmentar.

global mean temp

Temperatura mitjana global els darrers 150 anys. Figura adaptada de Robert A. Rohde.

Com és conegut, la causa principal d’aquest escalfament global és la producció per part dels humans de gasos d’efecte hivernacle, sobretot el CO2 i el CH4. En concret, la concentració de CO2 atmosfèric ha passat en 50 anys d’uns 300 a quasi 400 mg/l. Per a més informació vegeu aquesta pàgina: Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC).

Aquest escalfament global es fa patent a Espanya amb una tendència a l’augment de temperatura sobretot els mesos d’estiu, i una menor precipitació acumulada anual (Informe ECCE de J.M. Moreno Rodríguez, UCLM amb el Ministeri de Medi Ambient, 2005).

I això es reflecteix en la vitivinicultura en un avançament de les dates de verema, com veiem en la Figura d’aquí sota amb dades de Sarral, a la Conca de Barberà. Els darrers 30 anys hi ha hagut un augment de més de 3ºC en les temperatures mitjanes d’abril a agost, que és quan s’està fent el raïm, la qual cosa ha comportat un avançament de la verema de pràcticament un mes.

dates verema2

Augment de la Temperatura mitjana d’abril a agost i conseqüent avançament de la verema de Macabeu els darrers anys a la Conca de Barberà. Figura d’Oscar Saladié, URV, 2007.

S’avança la verema perquè els raïms ja són madurs des del punt de vista de màxima producció de sucres que donaran l’etanol amb la fermentació alcohòlica (o sigui la maduresa industrial), però les pells i especialment els pinyols encara són verds en aquest moment, encara no s’ha arribat a la maduresa fenòlica, la qual cosa comporta una major astringència i un caràcter herbaci no agradables al vi final. A més les altes temperatures també fan que l’acidesa sigui menor, i aquests pHs més alts donen lloc a un major risc de microorganismes contaminants (Brettanomyces per exemple) i menor intensitat colorant en vins negres. Un excès d’etanol produït degut a la major quantitat de sucres al raïm també és un problema, per als mateixos microorganismes, llevats i bacteris làctics, que duen a terme la fermentació alcohòlica i malolàctica respectivament. A més, entre altres problemes, els vins amb més alcohol tenen més rebuig per part de molts consumidors, i més taxes en alguns països.

Així doncs, el canvi climàtic comporta un seguit d’efectes negatius a la vitivinicultura i per això es va engegar el projecte CENIT DEMÉTER, per generar coneixements científics i tecnològics que permetessin atenuar aquests efectes.

raim-viDe la vinya al vi. Imatges tretes del vídeo elaborat per Procrea sobre el projecte Deméter.

El projecte CENIT DEMÉTER

El projecte va començar el 2008 amb la formació del consorci DEMÉTER entre 26 empreses (tant cellers com empreses auxiliars) del sector vitivinícola de tot Espanya (7 empreses catalanes, entre les quals Miguel Torres S.A., líder del projecte), juntament amb 29 grups de recerca (12 catalans) d’organismes públics d’investigació, tant d’universitats com de centres tecnològics.

008900mRelació d’empreses participants al projecte DEMÉTER. Imatge treta del vídeo elaborat per Procrea sobre el projecte.

009117mRelació de grups de recerca participants al projecte DEMÉTER. Imatge treta del vídeo elaborat per Procrea sobre el projecte.

El projecte fou finançat pel pla estratègic Ingenio 2010 gestionat pel CDTI dins del programa CENIT, impulsat i desenvolupat el 2006 per l’anterior govern socialista, per tal d’estimular la cooperació publico-privada en recerca industrial, subvencionant projectes consorciats de grans dimensions que tinguessin una planificació científico-tecnològica en àrees estratègiques de cara al futur. Durant els anys de vigència del programa CENIT es van finançar 91 projectes amb un total de 1071 milions €. En el cas del DEMÉTER el pressupost total ha estat d’uns 26 milions € per als 4 anys 2008-2012, amb una subvenció del 46% del CDTI.

009271m

Imatge treta del vídeo elaborat per Procrea sobre el projecte.

L’objectiu del projecte DEMÉTER ha estat realitzar una sèrie de projectes per aconseguir coneixements científics i tecnològics que permetin prendre mesures d’adaptació a les noves condicions produïdes per l’escalfament global i també per tal de contribuir a atenuar-ne les conseqüències, incloent l’estalvi d’aigua i minimitzar la petjada de CO2. El conjunt de projectes ha estat de caire multidisciplinar i interregional a nivel espanyol. El DEMÉTER s’ha estructurat en 7 àrees de la línia troncal, finançada per tot el consorci: Transcriptòmica de Vitis, Viticultura, Llevats, Bacteris Làctics, Anàlisi, Cava i Medi Ambient. I el projecte també ha inclòs tot un seguit de projectes de línies específics de cadascuna d’aquestes àrees, en cadascun dels quals han participat algunes de les empreses interessades conjuntament amb algun dels grups de recerca. Algunes de les noves tecnologies emprades, com entre altres, la transcriptòmica aplicada a la vinya, la metabolòmica de Saccharomyces, o els estudis d’expressió gènica d’Oenococcus, han suposat un salt tecnològic per al sector.

Podeu trobar més informació sobre el projecte a http://www.cenitdemeter.es/ i un bon resum al video (34 minuts) del projecte: http://www.youtube.com/watch?v=nW06e_umjsE&feature=plcp

Resum de resultats del projecte DEMÉTER

Els resultats més rellevants del projecte foren presentats a la Jornada de Clausura del passat 15 de novembre pels investigadors vinculats a la línia troncal del projecte, i a continuació els responsables de les empreses van compartir la seva experiència en el projecte i el més rellevant dels seus resultats específics.

En quant a l’estudi transcriptòmic de la vinya, s’han estudiat 800 gens associats a la maduració de les varietats Ull-de-llebre, Albariño i Verdejo, representatives de diferents climes (mediterrani, atlàntic i continental), en hivernacle, a dos temperatures i dos règims hídrics diferents, regant o no. S’ha vist que un augment de 3ºC fa augmentar sobretot l’expressió de gens de la síntesi de precursors de terpens, i en canvi s’ha observat una menor expressió dels transportadors d’antocians, que pot donar lloc a una reducció del color.

Els estudis de viticultura han confirmat que l’aplicació del reg és molt important com a atenuant dels efectes negatius de l’augment de temperatura, i sobretot s’ha estudiat quin és el moment òptim d’inici del reg. S’han realitzat treballs de viticultura de precisió, amb la posta a punt de tècniques d’imatges multiespectrals i sensors per tal de gestionar millor el tractament de les vinyes i la seva classificació de cara a la verema.

En el treball amb llevats s’ha desenvolupat un model metabòlic en cultiu continu per simular diferents moments de la fermentació alcohòlica, la qual cosa ha permès estudiar els diferents aspectes del procès fermentatiu que poden ser alterats pel canvi climàtic. També s’han desenvolupat marcadors bioquímics i moleculars de Saccharomyces indicadors de carències de nitrogen durant la fermentació alcohòlica.

Els resultats de la línia de bacteris làctics en la que hem treballat nosaltres els comento a l’apartat següent.

En aspectes analítics cal senyalar que s’ha aprofondit en el coneixement de l’evolució dels polifenols al llarg de la maduració i s’ha desenvolupat un prototipus per a mesurar aquest paràmetre als cellers. També s’han desenvolupat sistemes ràpids de mesura de Brettanomyces i sondes específiques per a bacteris làctics i acètics, que poden ser aplicats en el control de l’embotellat.

Per al procés del cava s’han desenvolupat metodologies d’anàlisi per millorar la qualitat de l’espuma, com la determinació de polisacàrids per HPLC d’exclusió. S’ha constatat que l’acidesa és un paràmetre clau de qualitat per al cava, amb la qual cosa cal optar per a l’avançament de la verema. Podeu veure una explicació dels efectes del canvi climàtic en el cas del cava i les possibles solucions per part del professor Fernando Zamora (URV) en aquest video: http://www.youtube.com/watch?v=Vz87Ynwt5nw

Finalment, dins les línies de medi ambient s’han realitzat estudis de reutilització d’aigües mitjançant bioreactors de membrana, i els treballs del sector del suro català sobre el cicle de vida dels productes han permès identificar els punts crítics de contaminació ambiental, per tal de corregir-los.

A més de l’ avenç tecnològic en la millora del sector vinícola espanyol que suposen tots aquests resultats, aquests 4 anys d’estudis compartits han estat un clar referent de col.laboració interempresarial i amb els centres de recerca. Les aliances establertes ja estan generant noves línies de recerca que donaran continuïtat a aquest projecte.

La nostra línia de Bacteris Làctics al projecte DEMÉTER

El nostre grupet (Bacteris Làctics, URV, Facultat d’Enologia de Tarragona) hem tingut l’oportunitat de participar aquests darrers 4 anys en la línia troncal del CENIT-DEMÈTER. Hi hem treballat 3 professors del Departament de Bioquímica i Biotecnologia (Cristina Reguant, Nicolas Rozès i jo mateix) junt amb una postdoc (Isabel Araque), una doctoranda que està acabant la tesi en aquest projecte (Meritxell Bordas) i dos estudiants de Màster (Joan Oriol Alegret i Paloma Toraño).

4fotosBLFragment del vídeo elaborat per Procrea amb la part de la nostra línia de bacteris làctics, cliqueu aquí: https://www.youtube.com/watch?v=WpdUgr7vN38&feature=g-upl

 

En la línia del que es comenta al video, els resultats més importants que hem obtingut són per un costat que hem seleccionat 2 soques de Oenococcus oeni (el bacteri que fa la fermentació malolàctica del vi), que tenen una alta tolerància a l’etanol, i per tant són soques candidates per ser estàrters de fermentació.

Per un altre costat, hem comparat aquestes soques tolerants amb altres que no ho són, analitzant quins són els gens clau que s’expressen més en les soques tolerants. Això ho hem fet tant quantificant els RNA de diversos gens concrets, així com realitzant transcriptòmica de tots els gens d’aquest bacteri mitjançant microxips, i hem vist que alguns gens relacionats amb la utilització del citrat i altres gens d’estrès són clau per a la tolerància a l’etanol.

Aquests resultats són útils per a quan es fa selecció de cultius utilitzables per inocular vins amb alta graduació alcohòlica, i per entendre millor com s’adapten els bacteris en funció de les condicions canviants del vi, i per obtenir característiques organolèptiques d’una òptima qualitat.

vinya-clima-microorg-viLa vinya, el canvi climàtic, els microorganismes que el fan i el producte biotecnològic final: el vi

Lluís Rabell

Activista, polític, company

Blog Cátedra de Historia y Patrimonio Naval

“Quien domina el mar, domina todas las cosas” (Temístocles)

No sé ni cómo te atreves

Fotografía y esas pequeñas cosas de cada día

Life Secrets

For my students

Horitzons llunyans

Mirades distants

#4wine

Los vinos son pequeñas historias dentro de una botella y nosotras queremos contarte las nuestras

Vi·moments·persones

Un maridatge a tres bandes

SciLogs: Artificial, naturalmente

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

microBIO

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

RealClimate

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

Quèquicom

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

Dionís de viatge a Ítaca

Experiències enoturístiques

A %d bloguers els agrada això: