Arxiu del Bloc

Un nou probiòtic activa la microbiota contra el càncer de fetge

Click here for the english version:  A new probiotic modulates gut microbiota against hepatocellular carcinoma

13 juliol 2016

Els darrers anys s’han anat desvetllant els efectes beneficiosos de la microbiota intestinal humana sobre diversos marcadors de la salut, com la inflamació, la resposta immune, les funcions metabòliques i el pes, així com la importància que tenen aquests bacteris simbiòtics nostres. En relació a la nostra microbiota vegeu per exemple aquests altres posts del meu blog: “Els clostridis bons ens eviten al·lèrgies“, “Bacteris controlant el que mengem” o “Bacteris de la llet materna“.

Al mateix temps s’ha vist que els probiòtics poden ser una bona solució per a moltes malalties amb la microbiota intestinal afectada. Efectivament, s’ha demostrat el paper beneficiós dels probiòtics per tal de reduir la inflamació gastrointestinal i prevenir el càncer colorectal.

Ara bé, recentment s’ha observat que els probiòtics poden tenir efectes beneficiosos en altres parts del cos més enllà del tracte gastrointestinal, en concret amb efectes immunomoduladors sobre un carcinoma hepatocel·lular (CHC). En efecte, investigadors de la Universitat de Hong Kong, juntament amb altres de la Universitat de Finlàndia Oriental, han publicat un estudi (Li et al, PNAS, 2016) en aquest sentit, en el qual han vist reduccions del 40% del pes i mida del tumor CHC del fetge de ratolins als que se’ls havia administrat un nou producte barreja de probiòtics, “Prohep”.

El carcinoma hepatocel·lular (CHC) és el tipus més usual de càncer de fetge, és el 2n càncer més mortal, i força abundant en llocs amb taxes altes d’hepatitis. A més, el fàrmac més utilitzat per reduir la proliferació del tumor, el sorafenib, és caríssim. El cost d’aquest inhibidor multiquinasa és de 3400€, per a les 112 pastilles de 200 mg del tractament recomanat de 4 pastilles al dia durant un mes. En canvi, qualsevol tractament amb probiòtics que s’arribés a demostrar que fos eficaç i pogués substituir aquest fàrmac, seria molt més econòmic.

La nova barreja de probiòtics Prohep està compost per diversos bacteris: Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), i el conjunt inactivat pel calor VSL#3 (1:1:1), que conté Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium breve, Bf. longum, Bf. infantis, Lb. acidophilus, Lb. plantarum, Lb. paracasei, i Lb. delbrueckii.

En el treball esmentat, Li et al. (2016) van alimentar ratolins amb el Prohep durant una setmana abans d’inocular-los un tumor al fetge, i van observar una reducció del 40% del pes i mida del tumor en comparació als animals control. Com veiem a la Figura 1, l’efecte és significatiu als 35 dies, i també per als que se’ls administra el Prohep el mateix dia de la inoculació del tumor. Lògicament, l’efecte de reducció és molt més manifest en administrar un compost antitumoral com Cisplatina.

Aquests investigadors van veure que la reducció del tumor era degut a la inhibició de l’angiogènesi, el procés que fa generar nous vasos sanguinis a partir dels existents, cosa essencial per al creixement tumoral. Relacionat amb la reducció tumoral, van trobar nivells alts del GLUT-1+ hipòxic, o sigui, que al tumor hi havia hipòxia causada pel menor flux sanguini, ja que aquest era un 54% menor, respecte als controls.

 

Fig 1 Li-Fig1B tumor size - days tumor

Figura 1. Variació de mida del tumor. ProPre: administració de Prohep 1 setmana abans d’inoculació del tumor; ProTreat: administració de Prohep el mateix dia d’inoculació del tumor; Cisplatin: administració d’aquest antitumoral. (Fig 1 B de Li et al, 2016).

 

També van determinar que hi havia una menor quantitat del factor angiogènic proinflamatori IL-17 i de les cèl·lules Th17 del sistema immune, que s’associen també al càncer. La menor inflamació i angiogènesi limiten el creixement del tumor.

I a més a més, aquests investigadors van establir que aquests efectes beneficiosos de l’administració dels probiòtics estava relacionats amb l’abundància de bacteris beneficiosos de la microbiota intestinal pròpia dels ratolins, que analitzaren per metagenòmica. O sigui, que els probiòtics modulen la microbiota, afavorint alguns bacteris propis, que són els que produeixen metabòlits antiinflamatoris com la citoquina IL-10 i que suprimeixen la diferenciació de les cèl·lules Th17.

 

Fig 2 gut microbiota Eye of Science

Figura 2. Bacteris de la microbiota intestinal humana al microscopi electrònic de rastreig (SEM) (Imatge colorejada, de Eye of Science / Science Source)

 

Alguns d’aquests bacteris de la microbiota identificats per metagenòmica als ratolins que se’ls havia administrat el Prohep són Prevotella i Oscillibacter. El primer és un bacteri gram-negatiu bacteroidal, que és abundant a la microbiota de nen africans rurals amb dietes riques en carbohidrats. Oscillibacter és un gram-positiu clostridial, que es coneix als humans com a productor del neurotransmissor GABA. Són un exemple més de la importància d’alguns bacteroidals i clostridials en la microbiota intestinal, ja que en són majoria, i malgrat que no són ni molt menys utilitzats com a probiòtics, cada cop se’ls troba més funcions positives, com per exemple evitant al·lèrgies (Els clostridis bons ens eviten al·lèrgies).

Se sap que aquests bacteris produeixen metabòlits antiinflamatoris i per tant serien els principals implicats en regular l’activitat de les cèl·lules immunes que propicien el creixement del tumor. La reducció del tumor observada en aquests experiments amb ratolins seria efecte de l’acció combinada dels mateixos bacteris probiòtics administrats junt amb la microbiota pròpia afavorida per aquests. Veiem un possible esquema d’aquestes accions a la Figura 3.

 

Fig 3 Sung fig 2

Figura 3. Diagrama simplificat dels possibles mecanismes dels bacteris intestinals influint sobre la polarització de les cèl·lules Th17 de la làmina pròpia de la mucosa intestinal. Els bacteris de la microbiota activarien les cèl·lules dendrítiques, les quals segreguen citoquines (IL-22, IL-23, IL-27). Els bacteris poden promoure la immunitat de Th17 induint IL-23, que pot estar involucrada mitjançant la senyal de lligands TLR, o ATP extracel·lular o l’amiloide A sèric (SAA). Mentrestant, algunes soques probiòtiques podrien inhibir el desenvolupament de Th17 per la via de la producció de IL-12 i IL-27, a banda d’afavorir el creixement i colonització dels bacteris propis que indueixen Th17 (Sung et al 2012, Fig. 2).

 

Encara que ja sabem que la progressió dels càncers és un procés molt complex, i que als microambients del tumor hi ha una infiltració de molts diversos tipus de cèl·lules del sistema immunitari com cèl·lules T, neutròfils, cèl·lules killer, macròfags, etc, la subpoblació de cèl·lules helper Th17 sembla que és prevalent en la progressió dels tumors, i per tant, aquests efectes dels probiòtics i la microbiota obren bones perspectives.

Encara és aviat per dir si aquests descobriments contribuiran a un tractament del càncer de fetge humà, i per tant calen investigacions en humans per veure si aquests probiòtics podrien ser utilitzats com a tal o en tàndem amb algun fàrmac, en funció del estadi i mida del tumor. En qualsevol cas, s’obre un nou ventall de possibilitats de recerca dels mecanismes moleculars dels efectes beneficiosos dels probiòtics més enllà del tracte intestinal.

 

Bibliografia

El-Nezami H (2016 april 27) HKU develops novel probiotic mixture “Prohep” that may offer potential therapeutic effects on liver cancer. The University of Hong Kong (HKU) 27 Apr 2016

El-Nezamy H, Lee PY, Huang J, Sung YJ (2015) Method and compositions for treating cancer using probiotics. Patent WO 2015021936 A1

Li J, Sung CYJ, Lee N, Ni Y, Pihlajamäki J, Panagiotou G, El-Nezami H (2016) Probiotics modulated gut microbiota suppresses hepatocellular carcinoma growth in mice. PNAS E1306-E1315

Oelschlaeger TA (2010) Mechanisms of probiotic actions – A review. Int J Med Microbiol 300, 57-62

Packham C (2016) Probiotics dramatically modulate liver cancer growth in mice. Medical Press, Med Research 23 Feb 2016

Silgailis M (2016) Treating some cancers with probiotics in the future ? Probiotic Prohep. Lacto Bacto: Health, Microbes and More 23 Feb 2016

Sung CYJ, Lee NP, El-Nezami H (2012) Regulation of T helper by bacteria: an approach for the treatment of hepatocellular carcinoma. Int J Hepatology ID439024, doi:10.1155/2012/439024

UEF News and Events (2016) A novel probiotic mixture may offer potential therapeutic effects on hepatocellular carcinoma. University of Eastern Finland 1 Mar 2016

 

Sorprenent: bacteris de l’acne humana a la vinya !!

Click here for the english version: Surprising: bacteria of human acne passed to the vineyard !! 

Realment sorprenent, però això sembla: uns investigadors italians i austríacs han publicat un treball (Campisano et al. 2014) on demostren que bacteris de l’espècie Propionibacterium acnes, relacionada amb l’acne humana, es troben com a endòfits obligats als teixits de l’escorça de Vitis vinifera, la vinya.

Alguns bacteris patògens dels humans, com Salmonella, són capaços de colonitzar teixits vegetals però de forma oportunista i temporalment (Tyler & Triplett 2008). De fet, hi ha un benefici mutu temporal entre plantes i bacteris, de manera que alguns d’aquests enterobacteris no patògens per a les plantes hi viuen endofíticament i poden ser beneficioses per a elles. Aquests patògens per als humans, en el seu cicle biològic utilitzen les plantes com a hostes alternatius per sobreviure al medi ambient, passant-hi mitjançant aigües de regadiu contaminades. Per tant, alguns bacteris sovint són hostes endòfits temporals de les plantes.

Però d’altra banda, són relativament rars els casos de bacteris que canviïn d’hoste i acabin adaptant-se al nou hoste, essent finalment endòfits fixos. Aquesta transferència horitzontal passa sobretot entre hostes propers evolutivament, com bacteris simbiòtics d’insectes àfids que s’ha demostrat que han passat a altres espècies d’àfids (Russell & Moran 2005). També s’ha suggerit la transferència horitzontal en bacteris làctics beneficiosos del tracte intestinal de vertebrats com Lactobacillus reuteri, del qual es troben soques semblants en diverses espècies de mamífers i aus.

Doncs bé, anant més enllà, en el treball de Campisano et al. objecte d’aquest comentari, es conclou que un tipus d’aquests bacteris relacionats amb l’acne humana haurien passat a la vinya, o sigui, els bacteris haurien fet una transferència horitzontal interregne, des d’animals mamífers a plantes.

 

Propionibacterium acnes tipus Zappae

L’acne, com sabeu, és una afecció humana consistent en un excès de secreció de les glàndules pilosebàcies de la pell causada per canvis hormonals, sobretot als adolescents. Les glàndules s’acaben inflamant, obstruint-se els porus i apareixent erupcions cutànies. El microorganisme associat a aquestes infeccions és el bacteri oportunista comensal P. acnes, bacil grampositiu anaeròbic aerotolerant, que s’alimenta dels àcids grassos del sèu produït per les glàndules.

fig1 Akne-jugend

Jove amb acne (Wikimedia, públic)

fig2

Propionibacterium acnes al microscopi electrònic de rastreig (esquerra) i tenyit amb cristall violeta (dreta). Tret de Abate ME (2013) Student Pulse 5, 9, 1-4.

 

Curiosament, altres espècies del mateix gènere Propionibacterium molt conegudes en biotecnologia microbiana industrial són les utilitzades per a la producció d’àcid propiònic, vitamina B12, i els formatges suïssos tipus Emmental o Gruyère.

Campisano et al. han fet un estudi de l’endomicrobioma de la vinya mitjançant la tècnica de seqüenciació (Roche 454) amplificant la regió hipervariable V5-V9 dels rDNA 16S bacterians presents als teixits vegetals de la planta. En 54 de les 60 plantes analitzades, entre un 0,5% i un 5% de les seqüències trobades corresponen a bacteris de l’espècie Propionibacterium acnes. Això ho han confirmat per observacions d’hibridació fluorescent in situ (FISH) amb fluorcroms i sondes específiques de P. acnes.

fig 3 FISH P acnes escorça vinya

Localització de P. acnes (taques blavoses fluorescents) a l’escorça d’una tija de vinya mitjançant microscòpia FISH amb sondes específiques d’aquest bacteri (Campisano et al 2004).

 

Els autors d’aquest treball proposen per a aquest bacteri trobat el nom de P. acnes Zappae, recordant l’excèntric músic i compositor Frak Zappa, per subratllar l’inesperat i gens convencional hàbitat d’aquest tipus de P. acnes.

 

fig 4 Frank Zappa

Frank Zappa (1940-1993), l’excèntric i satíric cantant, guitarrista i compositor. Foto: Frank Zappa reviews.

 

 

I cóm va passar aquest bacteri d’origen humà a la vinya ?

Per resoldre aquest enigma, Campisano et al. han agafat les seqüències 16S rDNA i d’altres gens (recA i tly), dels P. acnes Zappae que han trobat i les han comparat amb les dels P. acnes d’origen humà de les bases de dades. Comparant les filogènies i els clusters que es dedueixen, han arribat a concloure que P. a. Zappae s’ha diversificat evolutivament dels altres molt recentment. Estudiant-ne en detall les seqüències del gen recA de P. a. Zappae, i tenint en compte la seva taxa de mutació probable i el seu temps de generació (unes 5 h), dedueixen que la diversificació respecte als altres P. acnes es va produir fa uns 6000-7000 anys.

Aquesta data coincideix amb la domesticació coneguda de la vinya pels humans, que es creu que va tenir lloc fa uns 7000 anys a la regió meridional del Caucas, entre el mar Negre i el Caspi, entre les actuals Turquia, Georgia, Armenia i Iran (Berkowitz 1996). La vinya té l’origen en una subespècie silvestre de Vitis que va sobreviure l’Era glacial i va ser domesticada. De la planta originària en sortiren tres subespècies, i una d’elles, Vitis vinifera pontica,a la zona esmentada i més al sud a Mesopotàmia s’acabaria escampant per Europa gràcies alsfenicis.

Per tant, la conclusió és que P. a. Zappae es va originar a partir del P. acnes humà fa uns 7000 anys, pel contacte de les mans humanes amb els raïms i altres parts de la vinya en veremar-la i traginar-la. Tal com diuen els autors, aquest cas seria la primera evidència de transferència horitzontal interregne, des dels humans a les plantes, d’un bacteri simbiont obligat. A més, això fa més remarcable l’extrema adaptabilitat dels bacteris i que llur capacitat d’explotar nous hàbitats pot tenir impactes imprevistos en l’evolució de la relació hoste-simbiont o fins i tot hoste-patogen.

fig 5 m_so_america_hands_close

 Veremant a mà a Xile (Fine Wine and Good Spirits)

 

 

Bibliografia

Berkowitz M (1996) World’s earliest wine. Archaeology 49, 5, sept/oct.

Campisano Aet al. (2014) Interkingdom transfer of the acne-causing agent, Propionibacterium acnes, from human to grapevine. Mol Biol Evol 31, 1059-1065.

Gruber K (4 march 2014) How grapevines got acne bacteria. Nature News 4 march 2014.

Russell JA, NA Moran (2005) Horizontal transfer of bacterial symbionts: heritability and fitness effects in a novel aphid host. Appl Environ Microbiol 71, 7987-7994.

Tyler HL, EW Triplett (2008) Plants as a habitat for beneficial and/or human pathogenic bacteria. Ann Rev Phytopathol 46, 53-73.

Wikipedia, per descomptat: Propionibacterium acnes, Vitis, …

Walter J, RA Britton, S Roos (2011) PNAS 108, 4645-4652.

No hi ha tanta porqueria al “DNA brossa”: el projecte ENCODE

Encara que ja fa un parell de mesos (6 de setembre) que va sortir la notícia, ara m’he entretingut a mirar una mica més el projecte ENCODE (Encyclopedia Of DNA Elements). Tal com comentava la meva ex-alumna i amiga Andrea al blog de l’Associació de Biotecnòlegs de Catalunya en el seu article “Palabras y ADN”, fou una notícia força esbombada aquells dies als mitjans de comunicació, en el sentit que s’havia descobert que l’anomenat fins ara “DNA brossa” contenia molta informació útil i important, un tresor segons alguns mitjans. Bé doncs, anem a veure què és aquest tresor amagat, o més ben dit, quina és la rellevància d’aquest treball.

La paradoxa de la discordància entre nombre de gens i complexitat

Força abans de disposar dels genomes seqüenciats s’havia fet evident que la quantitat de DNA d’un organisme, i sobretot el nombre de gens, no es correspon amb la seva complexitat. Així, la quantitat de DNA del genoma d’un humà és aproximadament de 3.200 Mb (Mb o megabases, o sigui milions de parells de bases, ja sabeu, de les 4 possibles: A, T, G, C), i aquest DNA humà conté uns 23.000 gens, o sigui, les unitats que codifiquen per a alguna proteïna. Els altres mamífers tenen una quantitat semblant de DNA i de nombre de gens. En canvi, un cuc com Caenorhabditis (un nemàtode d`1 mm de llarg molt utilitzat als laboratoris com a animal model) té un DNA total de 100 Mb, però que conté informació per a 19.000 gens. O sigui, que el nostre nombre de gens és semblant al d’un ratolí, i només un 20% més gran que el d’un cuc. La comparació serviria igual respecte a insectes o plantes, i en alguns casos fins i tot tenen més gens que els humans, com la planta Arabidopsis amb uns 32.000 gens.

O sigui, està clar que la indubtable complexitat dels humans i els mamífers en general, respecte els invertebrats com els cucs, o respecte les plantes, no és deguda a la utilització d’un major nombre de gens. Cal entendre com el mateix nombre de gens és capaç de produir aquesta complexitat.

Aquests 23.000 gens dels humans que codifiquen per a proteïnes (transcrivint el DNA gènic a RNA missatger i traduint aquests a proteïnes als ribosomes) només suposen com a molt uns 150 Mb, o sigui, un 5% dels 3.000 Mb de DNA total. O sigui, que el 95% del genoma humà no codifica per a proteïnes. D’aquí va venir la suposició, ja des dels anys 1970, que tot aquest DNA aparentment no servia per a res, era “DNA brossa” (junk DNA).

De fet aquest terme de brossa ha estat utilitzat en sentit divulgatiu pels mitjans no especialitzats, ja que més correctament els científics sempre l’han anomenat DNA de funció desconeguda o DNA no-codificant, perquè està clar que alguna funció ha de tenir, i més tenint en compte aquesta complexitat dels organismes que tenen més DNA. Les seqüències de DNA no-codificant ja fa temps que se sap que són de diversos tipus, simplificant:

  • RNAs no codificants (que no es tradueixen a proteïnes), com els ribosomals, de transferència, microRNA i altres.
  • Elements reguladors que controlen la transcripció dels gens a RNA.
  • Introns, seccions no codificants internes del gen que són eliminats del RNA missatger.
  • Pseudogens, seqüències relacionades amb gens coneguts que han perdut evolutivament la seva funció.
  • Elements gènics mòbils, els transposons i retrotransposons, dels quals n’hi ha múltiples còpies per tot el genoma. Alguns dels retrotransposons estan relacionats amb elements virals.
  • Telòmers, les regions de DNA repetitiu a les regions finals dels cromosomes, que eviten el deteriorament d’aquests durant la replicació del DNA.

Com veiem, part d’aquest DNA no-codificant ja se sap que té una funció, però per a una gran part encara no està clar el seu paper.

Després del projecte del genoma humà, el projecte ENCODE

Com recordareu, el 2001 fou publicat a Nature (15 feb 2001) el primer esborrany del genoma humà per part del Consorci Internacional, i el 2003 en fou publicat el genoma complet. Aquest codifica el disseny bàsic, però la funció de la majoria dels 3.000 milions de bases segueix sent desconeguda. Un cop feta aquesta tasca del genoma, ja era evident que caldria també adquirir un coneixement enciclopèdic sobre l’organització de la cromatina (Figura 1), o sigui, el DNA enrotllat i replegat juntament amb proteïnes, les histones sobretot, per entendre com funciona i es regula l’expressió dels gens.

Amb aquest objectiu, que va lligat al mateix temps a entendre quines funcions té tot el DNA que no codifica per a proteïnes, va néixer el projecte ENCODE.

 Més enllà de la seqüènciaFigura 1. Més enllà de la seqüència (Ecker at al. 2012)

 

Així doncs, el projecte ENCODE té com a objectiu final aconseguir descriure com la informació dels gens humans es regula i s’expressa en elements funcionals, per tal d’orquestrar el desenvolupament i funcions d’un ser humà. Així, aquest projecte serà una eina poderosa més per lluitar millor contra les malalties.

En concret, el projecte conté dades del grau de metilació del DNA i de modificacions químiques de les histones que poden influir en la taxa de transcripció del DNA a molècules de RNA. També s’hi estudien les interaccions de gran abast de la cromatina, com els bucles, que alteren les proximitats relatives de diferents regions cromosòmiques en 3 dimensions i també afecten la transcripció..A més a més, el projecte descriu l’activitat d’unió al DNA dels factors de transcripció i la localització i seqüència dels elements de DNA reguladors gènics, que inclou les regions promotores properes als gens, però també elements reguladors més distants.

Una altra secció del projecte està dedicada a comprovar l’accessibilitat del genoma a l’acció de les proteïnes DNAsa I. Aquestes regions, anomenades llocs hipersensibles a DNAsa I, serveixen per indicar les seqüències específiques on la unió de factors de transcripció i altres proteïnes reguladores han causat desplaçaments dels nucleosomes (les “perles” d’histones al voltant dels quals està enrotllat el DNA). El projecte ENCODE també cataloga les seqüències i quantitats dels RNA transcrits, tant de les regions codificants com de les no-codificants.

logo EncodeFigura 2. Logo del projecte ENCODE

El consorci del projecte ENCODE

ENCODE és l’acrònim de ENCyclopedia Of DNA Elements, i el consorci públic de recerca que hi treballa fou impulsat pel National Human Genome Research Institute (NHGRI), depenent del NIH dels USA. El NHGRI fou el que impulsà el projecte del Genoma Humà. El projecte començà amb un Projecte Pilot el 2003, i vistos els bons resultats d’aquest gràcies sobretot al desenvolupament de noves tecnologies (per ex. piroseqüenciació) que generen una gran quantitat de dades dels elements funcionals, el 2007 s’augmentà l’escala del projecte ENCODE mitjançant nous finançaments del NHGRI. La inversió total es calcula en uns 185 milions de US$.

En el projecte ha tingut un paper clau la col·laboració entre diferents grups de recerca i la seva coordinació. Hi han participat 32 instituts de recerca de tot el món, si bé la majoria dels USA, amb alguns grups britànics, xinesos, alemanys i dos grups espanyols: el del Dr Roderic Guigó del Centre de Regulació Genòmica de Barcelona, i el Centre Nacional d’Investigació Oncològica de Madrid. Un total de 442 investigadors de tots aquests centres han realitzat un total de 1649 experiments, força d’ells de caràcter bioinformàtic, i durant 5 anys de feina (2007-2012) s’han acumulat 15000 GBytes d’informació en 12000 fitxers analitzats. L’anàlisi de les dades ha estat coordinat pel European Bioinformatics Institute del European Molecular Biology Laboratory, a Hinxton, Regne Unit.

Tots els resultats, un cop analitzats, han estat publicats en les bases de dades d’accès lliure a internet. Les publicacions principals del consorci han estat 30, de les quals 6 articles a Nature (6 septembre 2012), més 18 a Genome Research i 6 a Genome Biology, a banda de moltes altres més específiques (unes 80 fins ara) publicades per altres grups treballant amb les dades obtingudes al projecte.

Nature Encode coverFigure 3. Portada de la revista Nature amb l’anunci del projecte ENCODE, 6 setembre 2012

Mètodes utilitzats a l’ENCODE

El consorci ENCODE ha estudiat les dades corresponents a 1640 genomes, i per a 147 línies cel·lulars diferents. Des del 2007 els mètodes desenvolupats han permès realitzar un nombre ingent d’estudis de seqüenciació per mapejar elements funcionals d’una part del genoma humà, entenent com element funcional a qualsevol fragment genòmic que codifica un producte definit (per ex. una proteïna o un RNA no codificant) o té un paper reproduïble (per ex. la unió d’una proteïna o una estructura específica de la cromatina).

Els elements mapejats i els mètodes corresponents inclouen:

-Regions que transcriuen RNA, que es detecten per diferents tècniques: RNA-seq (o sigui seqüenciació d’alt rendiment dels cDNA obtinguts de RNA total), CAGE (Cap Analysis Gene Expression, o sigui l’anàlisi de les puntes 5’ dels RNAm transcrits mitjançant seqüenciació dels seus cDNA), RNA-PET (Paired-End-Tag, o sigui un mètode de seqüenciació per als mRNA transcrits sencers, ja que captura les dues puntes 5’ i 3’ i aconsegueix els millors resultats d’anotació de gens), i anotació manual de les seqüències.

-Regions que codifiquen proteïnes, detectades per espectrometria de mases.

-Llocs d’unió de factors de transcripció, detectats per ChIP-seq (que combina immunoprecipitació de cromatina, ChIP, amb la seqüenciació massiva en paral·lel de DNA, per identificar els llocs d’unió de les proteïnes associades al DNA), i per DNAsa-seq (que seqüencia les regions susceptibles de ser tallades per DNAses.

-Estructura de la cromatina, analitzada per DNAsa-seq, FAIRE-seq (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatorry Elements, mètode més sensible que la DNAsa-seq, sobretot per detectar elements reguladors distals), ChIP-seq de les histones, i MNasa-seq (seqüenciació d’àcids nucleics d’una sola cadena tallats amb MNasa, una nucleasa micrococal de Staphylococcus).

-Llocs de metilació del DNA, amb l’assaig RRBS (Reduced Representation Bisulphite Sequencing), que els detecta pel tractament amb bisulfit que converteix les citosines no metilades en uracil.

-Interaccions entre elements genètics. El superenrrotllament del DNA a la cromatina i l’empaquetament dels diversos cromosomes dins del nucli fan que hi hagi interaccions entre diversos elements genètics que influeixen en l’expressió. Per detectar-les s’utilitza el mètode 5C (Chromosome Conformation Capture Carbon Copy), que combina l’entrecreuament d’elements genètics, sintetitzant una biblioteca de fragments de DNA que interactuen, i identificant-los seqüenciació d’alt rendiment.

Finalment, per comparar i integrar els resultats dels diferents laboratoris, en la producció de dades es prioritzaren dos conjunts de línies cel·lulars, anomenats nivells (tier) 1 i 2. Les de nivell 1 d’alta prioritat eren línies molt estudiades: d’eritroleucèmia, cèl·lules mare embrionàries H1, i els B-limfoblastoids. Aquesta darrera també és una de les línies cel·lulars que forma part del projecte 1000 Genomes, que tot just ara se n’han publicat els resultats al Nature. Les línies cel·lulars del nivell (tier) 2 inclouen les del carcinoma cervical HeLa-S3, unes d’hepatoblastoma, i cèl·lules d’endoteli venós umbilical. Per tal de tenir un ample espectre de diversitat biològica del cos humà, els assajos també foren realitzats en la resta de línies cel·lulars fins a 147, agrupades en un nivell 3.

mètodes EncodeFigura 4. Esquema de diverses metodologies utilitzades al projecte ENCODE. Crèdits: Darryl Leja (NHGRI, Bethesda, MD, USA), Ian Dunham (European Bioinformatics Institute, Cambridge).

Manual del genomaFigura 5. Esquema global de les metodologies del projecte ENCODE (Maher, 2012), definit aquí com el “Manual del Genoma”.

Resultats principals

El mapejat sistemàtic al DNA humà de regions transcrites, de llocs d’unió de factors de transcripció, de l’estructura de la cromatina i de les modificacions de les histones dut a terme pel projecte ENCODE han permés assignar funcions bioquímiques a un 80% del genoma, i particularment a fora de les regions codificants per a proteïnes, acabant de descartar la visió que el genoma humà era sobretot DNA brossa. Es demostra que els espais entre els gens estan plens d’elements reguladors i nombroses regions que codifiquen RNAs que no es tradueixen en proteïnes però poden tenir funcions de regulació. Han trobat 400.000 reguladors de gens que augmenten o inhibeixen la seva expressió i 70.000 reguladors que activen altres gens. Tot plegat aporta noves perspectives als mecanismes de regulació gènica.

Els elements nous identificats també mostren una correspondència estadística amb seqüències variants lligades a malalties humanes, i per tant poden facilitar la interpretació d’aquestes variants. En fer estudis de les variants de seqüències genètiques associades amb algunes malalties en diferents individus (estudis GWAS, Genome-Wide Association Study), s’ha vist que els SNPs (single nucleotide polymorphisms, polimorfismes d’un sol nucleòtid) associats amb malalties són majoritaris als elements no codificants per a proteïnes. En molts casos, els fenotips de la malaltia poden ser associats amb un tipus cel·lular específic o un factor de transcripció.

En conjunt, el projecte aporta noves perspectives en l’organització i regulació dels nostres gens i genoma, i és un recurs expansiu d’anotacions funcionals per a la recerca biomèdica. Tanmateix, tot això només és el començament, tal com veiem a la Figura 5, ja que queden molts altres tipus cel·lulars per analitzar, a banda de desxifrar totes les interaccions trobades i desvetllar-ne el seu significat. El principal valor dels recursos del ENCODE no són les publicacions ara presentades, sinó la utilització de les dades per molts científics en els propers temps.

proteïna - DNA

Figura 6. Una proteïna acoblada al DNA (foto de Tom Ellenberger, Washington University School of Medicine in St. Louis, USA).

Bibliografia

PUBLICACIONS DEL ENCODE al Nature, 6 sept. 2012:

  • Explicació del projecte ENCODE: Ecker, J.R., Wendy A. Bickmore, Inês Barroso, Jonathan K. Pritchard, Yoav Gilad, Eran Segal (2012) Genomics: ENCODE explained. Nature 489, 52–55 (06 September 2012)
  • Nature Encode explorer: els 13 fils conductors, els principals temes, lligats als articles
  • Presentació del ENCODE: Skipper, M., R. Dhand, P. Campbell (2012) Presenting ENCODE. Nature 489, 45 (6 september 2012)
  • News Feature al Nature: Maher, B. (2012) ENCODE: The human encyclopaedia. Nature, News Feature 489, 46–48 (06 September 2012)
  • Nature, News & Views: Bickmore, W.A. (2012) 11 years ago: The draft human genome. Nature, News & Views, 489, 54 (06 september 2012)
  • La publicació “d’entrada” a Nature: The ENCODE Project Consortium (2012) An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature 489, 57-74 (06 september 2012).

VIDEO EXPLICANT EL PROJECTE ENCODE:

WEBS DE TREBALL DEL PROJECTE ENCODE:

ALTRES PROJECTES RELACIONATS:

I LA WIKIPEDIA:

No sé ni cómo te atreves

Fotografía y esas pequeñas cosas de cada día

Pols d'estels

El bloc d'Enric Marco

Life Secrets

For my students

All you need is Biology

Blog professional sobre Biologia · Blog profesional sobre Biología · A professional blog about Biology

Rambles of a PA student

Caffeinated forays into biological imaginings.

Horitzons llunyans

Mirades distants

#4wine

Los vinos son pequeñas historias dentro de una botella y nosotras queremos contarte las nuestras

Vi·moments·persones

Un maridatge a tres bandes

SciLogs: Artificial, naturalmente

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

microBIO

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

RealClimate

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

Què Qui Com

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

Dionís de viatge a Ítaca

Experiències enoturístiques

%d bloggers like this: