Arxiu del Bloc

Un nou probiòtic activa la microbiota contra el càncer de fetge

Click here for the english version:  A new probiotic modulates gut microbiota against hepatocellular carcinoma

13 juliol 2016

Els darrers anys s’han anat desvetllant els efectes beneficiosos de la microbiota intestinal humana sobre diversos marcadors de la salut, com la inflamació, la resposta immune, les funcions metabòliques i el pes, així com la importància que tenen aquests bacteris simbiòtics nostres. En relació a la nostra microbiota vegeu per exemple aquests altres posts del meu blog: “Els clostridis bons ens eviten al·lèrgies“, “Bacteris controlant el que mengem” o “Bacteris de la llet materna“.

Al mateix temps s’ha vist que els probiòtics poden ser una bona solució per a moltes malalties amb la microbiota intestinal afectada. Efectivament, s’ha demostrat el paper beneficiós dels probiòtics per tal de reduir la inflamació gastrointestinal i prevenir el càncer colorectal.

Ara bé, recentment s’ha observat que els probiòtics poden tenir efectes beneficiosos en altres parts del cos més enllà del tracte gastrointestinal, en concret amb efectes immunomoduladors sobre un carcinoma hepatocel·lular (CHC). En efecte, investigadors de la Universitat de Hong Kong, juntament amb altres de la Universitat de Finlàndia Oriental, han publicat un estudi (Li et al, PNAS, 2016) en aquest sentit, en el qual han vist reduccions del 40% del pes i mida del tumor CHC del fetge de ratolins als que se’ls havia administrat un nou producte barreja de probiòtics, “Prohep”.

El carcinoma hepatocel·lular (CHC) és el tipus més usual de càncer de fetge, és el 2n càncer més mortal, i força abundant en llocs amb taxes altes d’hepatitis. A més, el fàrmac més utilitzat per reduir la proliferació del tumor, el sorafenib, és caríssim. El cost d’aquest inhibidor multiquinasa és de 3400€, per a les 112 pastilles de 200 mg del tractament recomanat de 4 pastilles al dia durant un mes. En canvi, qualsevol tractament amb probiòtics que s’arribés a demostrar que fos eficaç i pogués substituir aquest fàrmac, seria molt més econòmic.

La nova barreja de probiòtics Prohep està compost per diversos bacteris: Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), i el conjunt inactivat pel calor VSL#3 (1:1:1), que conté Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium breve, Bf. longum, Bf. infantis, Lb. acidophilus, Lb. plantarum, Lb. paracasei, i Lb. delbrueckii.

En el treball esmentat, Li et al. (2016) van alimentar ratolins amb el Prohep durant una setmana abans d’inocular-los un tumor al fetge, i van observar una reducció del 40% del pes i mida del tumor en comparació als animals control. Com veiem a la Figura 1, l’efecte és significatiu als 35 dies, i també per als que se’ls administra el Prohep el mateix dia de la inoculació del tumor. Lògicament, l’efecte de reducció és molt més manifest en administrar un compost antitumoral com Cisplatina.

Aquests investigadors van veure que la reducció del tumor era degut a la inhibició de l’angiogènesi, el procés que fa generar nous vasos sanguinis a partir dels existents, cosa essencial per al creixement tumoral. Relacionat amb la reducció tumoral, van trobar nivells alts del GLUT-1+ hipòxic, o sigui, que al tumor hi havia hipòxia causada pel menor flux sanguini, ja que aquest era un 54% menor, respecte als controls.

 

Fig 1 Li-Fig1B tumor size - days tumor

Figura 1. Variació de mida del tumor. ProPre: administració de Prohep 1 setmana abans d’inoculació del tumor; ProTreat: administració de Prohep el mateix dia d’inoculació del tumor; Cisplatin: administració d’aquest antitumoral. (Fig 1 B de Li et al, 2016).

 

També van determinar que hi havia una menor quantitat del factor angiogènic proinflamatori IL-17 i de les cèl·lules Th17 del sistema immune, que s’associen també al càncer. La menor inflamació i angiogènesi limiten el creixement del tumor.

I a més a més, aquests investigadors van establir que aquests efectes beneficiosos de l’administració dels probiòtics estava relacionats amb l’abundància de bacteris beneficiosos de la microbiota intestinal pròpia dels ratolins, que analitzaren per metagenòmica. O sigui, que els probiòtics modulen la microbiota, afavorint alguns bacteris propis, que són els que produeixen metabòlits antiinflamatoris com la citoquina IL-10 i que suprimeixen la diferenciació de les cèl·lules Th17.

 

Fig 2 gut microbiota Eye of Science

Figura 2. Bacteris de la microbiota intestinal humana al microscopi electrònic de rastreig (SEM) (Imatge colorejada, de Eye of Science / Science Source)

 

Alguns d’aquests bacteris de la microbiota identificats per metagenòmica als ratolins que se’ls havia administrat el Prohep són Prevotella i Oscillibacter. El primer és un bacteri gram-negatiu bacteroidal, que és abundant a la microbiota de nen africans rurals amb dietes riques en carbohidrats. Oscillibacter és un gram-positiu clostridial, que es coneix als humans com a productor del neurotransmissor GABA. Són un exemple més de la importància d’alguns bacteroidals i clostridials en la microbiota intestinal, ja que en són majoria, i malgrat que no són ni molt menys utilitzats com a probiòtics, cada cop se’ls troba més funcions positives, com per exemple evitant al·lèrgies (Els clostridis bons ens eviten al·lèrgies).

Se sap que aquests bacteris produeixen metabòlits antiinflamatoris i per tant serien els principals implicats en regular l’activitat de les cèl·lules immunes que propicien el creixement del tumor. La reducció del tumor observada en aquests experiments amb ratolins seria efecte de l’acció combinada dels mateixos bacteris probiòtics administrats junt amb la microbiota pròpia afavorida per aquests. Veiem un possible esquema d’aquestes accions a la Figura 3.

 

Fig 3 Sung fig 2

Figura 3. Diagrama simplificat dels possibles mecanismes dels bacteris intestinals influint sobre la polarització de les cèl·lules Th17 de la làmina pròpia de la mucosa intestinal. Els bacteris de la microbiota activarien les cèl·lules dendrítiques, les quals segreguen citoquines (IL-22, IL-23, IL-27). Els bacteris poden promoure la immunitat de Th17 induint IL-23, que pot estar involucrada mitjançant la senyal de lligands TLR, o ATP extracel·lular o l’amiloide A sèric (SAA). Mentrestant, algunes soques probiòtiques podrien inhibir el desenvolupament de Th17 per la via de la producció de IL-12 i IL-27, a banda d’afavorir el creixement i colonització dels bacteris propis que indueixen Th17 (Sung et al 2012, Fig. 2).

 

Encara que ja sabem que la progressió dels càncers és un procés molt complex, i que als microambients del tumor hi ha una infiltració de molts diversos tipus de cèl·lules del sistema immunitari com cèl·lules T, neutròfils, cèl·lules killer, macròfags, etc, la subpoblació de cèl·lules helper Th17 sembla que és prevalent en la progressió dels tumors, i per tant, aquests efectes dels probiòtics i la microbiota obren bones perspectives.

Encara és aviat per dir si aquests descobriments contribuiran a un tractament del càncer de fetge humà, i per tant calen investigacions en humans per veure si aquests probiòtics podrien ser utilitzats com a tal o en tàndem amb algun fàrmac, en funció del estadi i mida del tumor. En qualsevol cas, s’obre un nou ventall de possibilitats de recerca dels mecanismes moleculars dels efectes beneficiosos dels probiòtics més enllà del tracte intestinal.

 

Bibliografia

El-Nezami H (2016 april 27) HKU develops novel probiotic mixture “Prohep” that may offer potential therapeutic effects on liver cancer. The University of Hong Kong (HKU) 27 Apr 2016

El-Nezamy H, Lee PY, Huang J, Sung YJ (2015) Method and compositions for treating cancer using probiotics. Patent WO 2015021936 A1

Li J, Sung CYJ, Lee N, Ni Y, Pihlajamäki J, Panagiotou G, El-Nezami H (2016) Probiotics modulated gut microbiota suppresses hepatocellular carcinoma growth in mice. PNAS E1306-E1315

Oelschlaeger TA (2010) Mechanisms of probiotic actions – A review. Int J Med Microbiol 300, 57-62

Packham C (2016) Probiotics dramatically modulate liver cancer growth in mice. Medical Press, Med Research 23 Feb 2016

Silgailis M (2016) Treating some cancers with probiotics in the future ? Probiotic Prohep. Lacto Bacto: Health, Microbes and More 23 Feb 2016

Sung CYJ, Lee NP, El-Nezami H (2012) Regulation of T helper by bacteria: an approach for the treatment of hepatocellular carcinoma. Int J Hepatology ID439024, doi:10.1155/2012/439024

UEF News and Events (2016) A novel probiotic mixture may offer potential therapeutic effects on hepatocellular carcinoma. University of Eastern Finland 1 Mar 2016

 

El panda gegant és herbívor però té una microbiota intestinal de carnívor

Click here for the english version: The giant panda is herbivore but has the gut microbiota of a carnivore

26 agost 2015

El panda gegant (Ailuropoda melanoleuca, literalment en grec “peu de gat negre i blanc”) és una de les espècies de mamífers més intrigants evolutivament. Malgrat la seva dieta exclusivament herbívora, filogenèticament és com un ós, ja que és de la família Úrsids, dins l’ordre Carnívors. La seva dieta és 99% de bambú i l’altre 1% és mel, ous, peix, taronges, plàtans, nyams i fulles d’arbusts.

Viu en algunes serralades de la Xina central, principalment a la província de Sichuan, i també a les províncies de Shaanxi i Gansu. Degut a la construcció de granges, desforestació i altres desenvolupaments, el panda ha estat foragitat de les terres baixes on havia viscut. És una espècie en perill d’extinció que necessita protecció. Hi han uns 300 en captivitat i uns 3000 en llibertat. Malgrat que els nombres estan augmentant, segueix en perill d’extinció, sobretot pel seu espai limitat (uns 20.000 km2) i l’hàbitat molt específic (boscos de bambú).

Fig0 panda bamboo

Així doncs, el panda gegant té una dieta quasi exclusiva de diferents espècies de bambú, sobretot de fulles i tiges, molt fibroses, i els brots tendres a la primavera i estiu. És per tant una dieta de poca qualitat digestiva, amb poca proteïna i molta fibra i contingut de lignina. Es passen unes 14 h al dia menjant, i poden arribar a ingerir uns 12 kg de bambú al dia.

La majoria d’herbívors tenen modificacions del tracte digestiu que ajuden a la retenció de l’aliment en procés de digestió, i contenen poblacions microbianes que els permeten utilitzar com a menja exclusiva els materials vegetals rics en polisacàrids complexos, com la cel·lulosa i hemicel·lulosa. Aquestes especialitzacions poden ser la compartimentació de l’estómac, típica dels remugants i altres no remugants (cangurs, hàmster, hipopòtams i alguns primats) o bé l’engrandiment de l’intestí gros, característic dels èquids, alguns rosegadors i els lagomorfs (conills i llebres).

En canvi, i malgrat el seu règim exclusivament herbívor, sorprenentment el panda gegant té un tracte gastrointestinal típic dels carnívors, anatòmicament similar als del gos, el gat o l’ós rentador, amb un estómac simple, té el cec degenerat i el còlon és molt curt. El tracte gastrointestinal dels pandes és unes 4 vegades la mida del cós, com altres carnívors, mentre que als herbívors és unes 10-20 vegades el cós, per tal de digerir eficientment grans quantitats de farratge. Amb això, el temps del trànsit intestinal del panda és molt curt, menys de 12 h. Tot això limita molt la capacitat de possibilitats fermentatives dels materials vegetals (Williams et al. 2013).

Per aquests motius, la digestió del bambú per al panda és molt ineficient, malgrat la seva dependència. Els pandes consumeixen l’equivalent al 6% del seu pes corporal per dia, amb una digestibilitat de la matèria seca del bambú del 20%. D’aquest, un 10% correspon a la poca proteïna que conté el bambú, i la resta és dels polisacàrids, en concret amb uns coeficients de digestió del 27% per a les hemicel·luloses i del 8% per a la cel·lulosa.

Sembla com si el panda gegant s’hagués especialitzat en el consum d’una planta amb alt contingut en fibra, sense haver modificat l’aparell digestiu, a base d’una masticació eficient, ingerint-ne grans quantitats, digerint els continguts cel·lulars enlloc de les parets cel·lulars vegetals, i excretant ràpidament els residus no digerits (Dierenfield et al. 1982).

A més a més, tenir una dependència d’un sol tipus de planta com és el bambú pot comportar mancances nutricionals segons els cicles estacionals de la planta. En aquest sentit, recentment (Nie et al. 2015) s’han estudiat les concentracions de calci, fòsfor i nitrogen de les diferents parts del bambú que mengen una població de pandes lliures. Han vist que els pandes dins del seu hàbitat fan una migració estacional en dues zones de diferent alçada al llarg de l’any i que s’alimenten de dues espècies diferents de bambú. Ambdues espècies tenen més calci a les fulles i més fòsfor i nitrogen a les tiges. Com que la variació estacional d’aparició i caiguda de fulles de les 2 espècies és diferent a causa de la diferent alçada, quan els pandes són en una de les zones mengen les fulles d’una de les espècies i les tiges de l’altre, mentre que ho fan al revés quan són a l’altra zona. O sigui, que els pandes sincronitzen les seves migracions estacionals per tal de treure’n el màxim rendiment nutricional d’ambdues especies de bambú.

Un altre inconvenient de la dependència del bambú és la seva floració. És un fenomen natural que passa cada 40-100 anys, i quan el bambú floreix, es mor, reduint la disponibilitat de menjar per als pandes. Pels anys 1970-1980 hi hagués dues floracions a gran escala a l’hàbitat dels pandes, i hi van haver més de 200 morts per aquesta raó. Tanmateix, i donat que segurament els pandes s’han trobat en la seva evolució amb moltes altres floracions massives, quan s’hi troben cerquen altres espècies de bambú o recorren llargues distàncies per cobrir les seves necessitats alimentàries (Wei et al. 2015).

En compensació, i com a adaptació a aquest menjar tant específic, el panda gegant té una sèrie de característiques morfològiques úniques, com unes fortes mandíbules i molars molt poderosos, i sobretot un pseudo-polze, com si tingués 6 dits, que és l’ós sesamoide radial engrandit, fent com un polze oposable, que li serveix per agafar millor les canyes de bambú (Figura 1).

Fig1 panda's thumb

Figura 1. El pseudo-polze del panda gegant. Imatge treta de Herron & Freeman (2014).


I cóm és que el panda va passar a ser herbívor ?

S’ha estimat que el precursor del panda gegant, omnívor com altres úrsids, va començar a menjar bambú com a mínim fa 7 milions d’anys (Ma), i va esdevenir completament dependent del bambú entre 2 i 2,4 Ma. Aquest canvi de dieta probablement va anar lligat a diverses mutacions al seu genoma, donant lloc a defectes del metabolisme de la dopamina en relació a l’apetència per la carn, i sobretot de la pseudogenització del gen Tas1r1 (Figura 2), del receptor del gust d’umami (Jin et al. 2011). L’umami és un dels 5 gustos bàsics, junt amb el dolç, salat, àcid i amarg, i ve a ser com el gust “saborós”, que normalment recorda la carn, i està relacionat amb el L-glutàmic, abundant a la carn. Aquesta mutació que feia prescindir al panda del gust umami afavorí la pèrdua d’apetit del panda per la carn i reforçà el seu estil de vida herbívor. Tanmateix, probablement altres factors addicionals devien estar implicats, ja que el gen Tas1r1 està intacte en herbívors com el cavall i la vaca (Zhao et al. 2010).

Fig2 Zhao F1 large

Figura 2. Arbre filogenètic d’alguns carnívors amb les dates per al panda gegant deduïdes dels fòssils (en blau) i de l’estudi molecular del gen TasTr1 fet per Zhao et al. (2010).


La microbiota intestinal del panda

Com era d’esperar, en fer la seqüenciació del genoma complet del panda gegant (Li et al. 2010) no s’han trobat gens específics responsables de la digestió de la cel·lulosa i hemicel·luloses. Lògicament, la possible digestió d’aquests polisacàrids complexos de les fibres del bambú aniria a càrrec dels microorganismes cel·lulolítics del tracte intestinal. Cal estudiar per tant si hi són al panda.

En estudiar les seqüències del 16S ribosomal de les microbiotes fecals dels diversos mamífers s’observa en general un augment de la diversitat bacteriana en sentit carnívors – omnívors – herbívors (Ley et al. 2008). Aquesta diversitat és menor en els pandes que als herbívors, i com veiem a la Figura 3, els pandes queden agrupats amb els carnívors (cercles vermells) malgrat ser herbívors del punt de vista de dieta.

Fig3 Ley

Figura 3. Anàlisi de components principals (PC) de les comunitats bacterianes fecals de mamífers amb diferents colors segons la dieta predominant (Ley et al. 2008)


La microbiota intestinal de la majoria dels herbívors conté sobretot bacteris anaerobis dels grups de Bacteroides, Clostridials, Fibrobacterals i Espiroquetals, que tenen les capacitats enzimàtiques per degradar els materials fibrosos vegetals i així proveeixen de nutrients als seus hostes. Al contrari, els omnívors i sobretot els carnívors tenen una microbiota predominant d’anaerobis facultatius, com les Enterobacteriaceae, a banda d’alguns Firmicutes, que inclouen Clostridials i alguns Lactobacil als, i Bacteroides.

En quant al panda gegant, els primers estudis fets amb mètodes tradicionals dependents de cultiu i anàlisi dels gens 16S rRNA amplificats (Wii et al. 2007) van identificar les Enterobacteriaceae i Streptococcus com a predominants en la microbiota intestinal. Per tant, aquest estudi suggeria que la microbiota del panda és molt semblant a la dels carnívors, com veiem en l’estudi comentat comparatiu de diversos mamífers (Ley et al. 2008), i per tant amb molt poca capacitat d’utilitzar cel·lulosa o hemicel·lulosa.

Tanmateix, un estudi posterior fet amb tècniques de seqüenciació del 16S (Zhu et al. 2011) a partir de mostres fecals de 15 pandes gegants va arribar a unes conclusions ben diferents i semblava que van trobar per primer cop proves de la digestió de cel·lulosa per la microbiota del panda gegant. En analitzar 5500 seqüències, van trobar 85 tàxons diferents, dels quals el 83% eren Firmicutes (Figura 4), i entre aquests n’hi havia 13 tàxons de Clostridium (7 d’ells exclusius dels pandes), i alguns d’aquests amb capacitat de digestió de cel·lulosa. A més, amb anàlisi metagenòmica d’alguns dels pandes van trobar alguns gens putatius per a enzims per digerir cel·lulosa, beta-glucosidasa i xilan-1,4-beta-xilosidasa per a aquests Clostridium. Tot plegat, van concloure que la microbiota del panda gegant tenia una moderada capacitat de degradació dels materials cel·lulòsics.

Fig4 Zhu 2011-Fig1C

Figura 4. Percentatges de seqüències dels principals grups bacterians trobats a les mostres fecals d’individus de panda gegant salvatges (W1-W7) i en captivitat (C1-C8) segons Zhu et al. (2011). Sota cada individu s’indica el n. de seqüències analitzades.


Però, tot just fa dos mesos s’ha publicat un treball (Xue et al. 2015) que sembla tornar enrere, concloent que la microbiota intestinal del panda gegant és molt semblant a la dels carnívors i poca cosa té d’herbívora. És un treball exhaustiu de seqüenciació massiva d’última generació del 16S rDNA amb mostres fecals de 121 pandes de diferents edats al llarg de tres estacions de l’any. Han obtingut unes 93000 seqüències, corresponents a 781 tàxons diferents.

Han trobat una predominança de Enterobacteriaceae i de Streptococcus (vermell fosc i blau fosc respectivament, Figura 5 A), i molts pocs representants dels probables cel·lulolítics com els Clostridials. A més, aquests no es veuen augmentats quan hi ha més fulles i tiges de bambú disponibles (fase T3). Aquests resultats es corresponen amb el que ja se sabia del baix nombre de gens de cel·lulases i hemicel·lulases, un 2%, fins i tot menor que al microbioma dels humans. Aquesta negligible contribució de la microbiota a la digestió de la cel·lulosa, junt amb el fet comentat que el panda és força ineficient digerint el bambú, contradiu la hipotètica importància de la digestió per part de la microbiota que s’havia suggerit pocs anys abans, com hem vist abans.

A més, en aquest treball s’ha vist molta varietat de composició de microbiota entre individus (Figura 5 B).

Fig5 Xue F1 large

Figura 5. Composició de la microbiota intestinal de 121 pandes gegants, amb (A) els gèneres dominants a totes les mostres i (B) la contribució relativa dels gèneres dominants a cada individu, agrupats per edat i temps de mostreig (Xue et al. 2015).


En aquest treball, quan han fet l’anàlisi comparativa entre la composició de la microbiota intestinal del panda gegant amb la d’altres mamífers de les diferents dietes, han confirmat que el panda s’agrupa altre cop amb els carnívors i queda ben lluny dels herbívors (Figura 6).

Fig6 Xue Fig4

Figura 6. Anàlisi de components principals de les comunitats de les microbiotes de mostres fecals de 121 pandes gegants (formes en blanc), en comparació amb les d’altres herbívors (verd), omnívors (blau) i carnívors (vermell). Les diferents formes corresponen a diferents treballs: els cercles són de Xue et al. (2015), el treball d’on s’ha tret la Figura.


Tot plegat, les característiques peculiars de la microbiota del panda gegant contribueixen al perill d’extinció que pateix. Al contrari que la majoria d’altres espècies de mamífers que han evolucionat les seves microbiotes i anatomies digestives optimitzant-les per a les seves dietes específiques, l’aberrant coevolució del panda, la seva microbiota i la seva dieta particular, és ben bé enigmàtica. Per aclarir-ho i saber com preservar aquest animal amenaçat, caldrà seguir estudiant-ho combinant metagenòmica, metatranscriptòmica, metaproteòmica i meta-metabolòmica per conèixer bé la estructura i el metabolisme de la microbiota intestinal i la seva relació amb les funcions digestives i l’estatus nutritiu del panda gegant (Xue et al. 2015).

Referències

Dierenfield ES, Hintz HF, Robertson JB, Van Soest PJ, Oftedal OT (1982) Utilization of bamboo by the giant panda. J Nutr 112, 636-641

Herron JC, Freeman S (2014) Evolutionary Analysis, 5th ed. Benjamin Cummings

Jin K, Xue C, Wu X, Qian J, Zhu Y et al. (2011) Why Does the Giant Panda Eat Bamboo? A Comparative Analysis of Appetite-Reward-Related Genes among Mammals. PLos One 6, e22602

Ley RE, Hamady M, Lozupone C, Turnbaugh PJ, Ramey RR et al. (2008) Evolution of Mammals and Their Gut Microbes. Science 320, 1647-1651

Li R, Fan W, Tian G, Zhu H, He L et 117 al. (2010) The sequence and de novo assembly of the giant panda genome. Nature 463, 311–317

Nie Y, Zhang Z, Raubenheimer D, Elser JJ, Wei W, Wei F (2015) Obligate herbivory in an ancestrally carnivorous lineage: the giant panda and bamboo from the perspective of nutritional geometry. Functional Ecology 29, 26–34

Rosen M (2015) Pandas’ gut bacteria resemble carnivores. Science News 19/05/2015

Wei G, Lu H, Zhou Z, Xie H, Wang A, Nelson K, Zhao L (2007) The microbial community in the feces of the giant panda (Ailuropoda melanoleuca) as determined by PCR-TGGE profiling and clone library analysis. Microb Ecol 54, 194–202

Wei F, Hu Y, Yan L, Nie Y, Wu Q, Zhang Z (2014) Giant Pandas Are Not an Evolutionary cul-de-sac: Evidence from Multidisciplinary Research. Mol Biol Evol 32, 4-12

Williams CL, Willard S, Kouba A, Sparks D, Holmes W et al. (2013) Dietary shifts affect the gastrointestinal microflora of the giant panda (Ailuropoda melanoleuca). J Anim Physiol Anim Nutr 97, 577-585

Xue Z, Zhang W, Wang L, Hou R, Zhang M et al. (2015) The bamboo-eating giant panda harbors a carnivore-like gut microbiota, with excessive seasonal variations. mBio 6(3), e00022-15

Zhao H, Yang JR, Xu H, Zhang J (2010) Pseudogenization of the Umami Taste Receptor Gene Tas1r1 in the Giant Panda Coincided with its Dietary Switch to Bamboo. Mol Biol Evol 27(12), 2669–2673

Zhu LF, Wu Q, Dai JY, Zhang SN, Wei FW (2011) Evidence of cellulose metabolism by the giant panda gut microbiome. Proc Natl Acad Sci USA 108, 17714–17719.

Els bacteris de la vinya i del “terroir”, i presència d’Oenococcus als raïms del Priorat

Click here for the english version: Bacteria of vineyard and terroir, and presence of Oenococcus in Priorat (South Catalonia) grapes

22 abril 2015 

Els viticultors creuen que la terra en la qual creixen les vinyes dóna una qualitat única als seus vins, i d’això en diuen el terroir, o terrer si ho traduïm al català. Es pot considerar que la resposta fisiològica de les vinyes al tipus de sòl i les condicions climàtiques, juntament amb les característiques de la varietat i la forma de cultiu, donen lloc a unes propietats organolèptiques del vi que defineixen el seu terroir (Zarraonaindia et al 2015). Ara bé, no es coneix gaire si hi podria haver una microbiota específica de cada terroir, ja que aquest tema s’ha estudiat relativament poc.

Els microorganismes vínics als raïms ? Saccharomyces no hi és o no se’l troba

Els principals protagonistes de les fermentacions víniques, la alcohòlica (Saccharomyces cerevisiae) i la malolàctica (Oenococcus oeni) normalment no apareixen fins que el most està fermentant, ja doncs al celler. En condicions normals de raïms sans, pràcticament no es troba S. cerevisiae.

Oenococcus oeni als raïms ? Em sembla que nosaltres l’hem trobat !

En quant a O. oeni, fins ara s’ha publicat molt poc sobre la seva presència i aïllament en els raïms. En diversos treballs, com Sieiro et al (1990), o més recentment Bae et al (2006), ja havien aïllat alguns bacteris làctics de la superfície de raïms, però no O. oeni. Només Garijo et al (2011) van aconseguir aïllar una colònia (una només) d’O. oeni a partir de raïms de la Rioja. D’altra banda, s’ha detectat el DNA d’O. oeni en alguna mostra de raïms de Bordeus (Renouf et al 2005, Renouf et al 2007) per PCR-DGGE del gen rpoB, encara que no van aïllar cap bacteri d’aquesta espècie.

Em plau poder comentar que recentment al nostre grup hem aconseguit aïllar O. oeni dels raïms i tipificar-ne diverses soques, i justament estem elaborant una publicació al respecte (Franquès et al 2015). Efectivament, l’equip de recerca de bacteris làctics BL-URV, junt amb els companys de llevats del mateix grup de Biotecnologia Enològica (Facultat d’Enologia de la Universitat Rovira i Virgili a Tarragona) estem treballant en un projecte europeu, el “Wildwine” (FP7-SME-2012 -315065), que té per objectius analitzar els microorganismes autòctons (d’aquí lo de “wild”) del sistema vitivinícola del Priorat, i seleccionar-ne soques amb potencial enològic. Al projecte també hi participen la DOQ Priorat i el celler Ferrer-Bobet, així com grups de recerca i associacions de cellers de Bordeus, el Piemont i Grècia. En el marc d’aquest projecte vam prendre mostres de raïms (garnatxa i carinyena) de diverses finques del Priorat (Figura 1), així com també de vins realitzant la fermentació malolàctica, i en vam obtenir uns 1900 aïllats de bacteris làctics. Vam optimitzar l’aïllament a partir dels raïms a partir de la polpa i del most amb diversos mètodes d’enriquiment, i així vam obtenir uns 110 aïllats de raïms, identificats com O. oeni per tècniques moleculars específiques. Un cop tipificats, hem comprovat que els seus perfils moleculars no coincideixen amb soques comercials i per tant són autòctones. A més, alguns d’aquests aïllats dels raïms també els hem trobat als vins fets als cellers corresponents.

Fig 1 garna-cari Priorat

Figura 1. Prenent mostres de garnatxa (esquerra) i carinyena (dreta) de finques del Priorat per tal d’aïllar bacteris làctics com Oenococcus (Fotos Albert Bordons).


La microbiota dels raïms

Els raïms tenen una ecologia microbiana complexa que inclou llevats, fongs micelials i bacteris. Alguns només es troben als raïms, com els fongs paràsits i els bacteris ambientals, i altres tenen la capacitat de sobreviure i créixer als vins: sobretot llevats, bacteris làctics i bacteris acètics. La proporció de tots plegats depèn de l’estat de maduració del raïm i de la disponibilitat de nutrients.

Quan els fruits són intactes, la microbiota predominant són els llevats basidiomicets com Cryptococcus i Rhodotorula, però quan són més madurs, comencen a tenir microfisures que faciliten la disponibilitat de nutrients i expliquen la predominança just abans de la verema d’ascomicets lleugerament fermentatius com Candida, Hanseniaspora, Metschnikowia i Pichia. Quan la pell ja està més danyada poden aparèixer llevats perjudicials com Zygosaccharomyces i Torulaspora, i bacteris acètics. Entre els fongs filamentosos poden haver-hi ocasionalment alguns molt perjudicials com Botrytis (la podridura) o Aspergillus productors d’ocratoxina, que encara que només són actius a la vinya, els seus productes poden afectar la qualitat del vi.

D’altra banda, a la superfície dels raïms s’han aïllat bacteris ubics ambientalment com diversos enterobacteris, Bacillus, i estafilococs, però cap d’ells pot créixer al vi (Barata et al 2012).

Tornant a la possible microbiota específica del terroir, s’ha vist que alguns compostos volàtils que contribueixen a l’aroma del vi, com 2-metil-butanoic o 3-metil-butanol, són produïts per microorganismes aïllats a les vinyes, com el bacteri grampositiu Paenibacillus, o el fong basidiomicet Sporobolomyces o l’ascomicet Aureobasidium. Per tant, podria haver una relació entre algunes de les espècies microbianes trobades a la vinya i alguns aromes detectats al vi, procedents del most, és clar (Verginer et al 2010).

La metagenòmica com a eina analítica de la microbiota dels raïms

Donat que els mètodes clàssics d’aïllament i cultiu dels microorganismes són lents, laboriosos i alguns dels microbis no s’aconsegueix fer-los créixer en els medis d’aïllament, actualment es recorre als mètodes de seqüenciació massiva o metagenòmica. Aquests consisteixen en analitzar el DNA present i a partir de les seqüències, deduir amb les bases de dades quins són els microorganismes presents a la mostra. En el cas dels bacteris sovint s’utilitza el DNA amplificat del fragment V4 del gen 16S RNA (Caporaso et al 2012).

S’ha utilitzat en mostres de vins botrititzats (Bokulich et al 2012) i s’han trobat proporcions de diversos bacteris làctics (però no Oenococcus), inclosos alguns no associats normalment a vi. També s’ha utilitzat per veure la microbiota resident als cellers i com canvia segons les estacions, comprovant que a les superfícies dels dipòsits i maquinària del celler hi ha una majoria de microorganismes no relacionats amb el vi ni tampoc perjudicials (Bokulich 2013).

Amb aquesta tècnica Bokulich et al (2014) també han analitzat els raïms i han vist diferències clares entre les proporcions dels diversos grups bacterians (i de fongs) entre diferents llocs, diferents varietats, i també segons les condicions ambientals o biogeogràfiques. Per exemple, en analitzar 273 mostres de mostos de raïms de Califòrnia, les 3 varietats (Cabernet, Chardonnay i Zinfandel) queden bastant discriminades en una anàlisi de components principals respecte a les comunitats bacterianes trobades a cada mostra (Figura 2).

Així doncs, els grups o taxons bacterians dominants en una varietat o ambient determinat podrien aportar unes característiques específiques en aquells vins, i això podria explicar alguns patrons regionals o de terroir en les propietats organolèptiques d’aquests vins (Bokulich et al 2014).

Fig 2 ACP Bokulich 2014

Figura 2. Anàlisi de components principals de les comunitats bacterianes de mostres de mostos de raïms de Sonoma (Califòrnia) de 3 varietats diferents (Cabernet en vermell, Chardonnay en verd i Zinfandel en blau) (Bokulich et al 2014).


Nosaltres també hem realitzat un estudi de seqüenciació massiva amb les mostres de raïms de les quals hem obtingut aïllats d’O. oeni, com he comentat abans (Franquès et al 2015), i en més 600.000 seqüències del rRNA 16S analitzades hem trobat sobretot Proteobacteris i Firmicutes. Entre aquests grampositius, hem trobat seqüències de bacteris làctics (un 15%) i d’aquests hem pogut confirmar amb èxit la presència d’O. oeni en un 5% de les seqüències. Per tant, hem aïllat O. oeni dels raïms i n’hem detectat el seu DNA en força mostres.

La microbiota bacteriana de tota la vinya i del sòl

Com veiem, s’ha estudiat una mica la microbiota dels raïms i dels vins, però molt menys la microbiota dels sòls, la qual pot definir més bé el terroir, que està influït pel clima local i les característiques de la vinya.

Veiem a la Figura 3 un resum dels principals gèneres trobats a les diferents parts de la vinya i al sòl (Gilbert et al 2014).

Fig 3 Gilbert 2014

Figura 3. Principals bacteris i fongs associats als òrgans i sòl de Vitis vinifera (Gilbert et al 2014)


Recentment s’ha publicat un treball interessant (Zarraonaindia et al 2015) sobre aquest tema, amb l’objectiu de veure si el sòl podria ser la principal font de bacteris que colonitzen els raïms. Han agafat mostres de sòl, arrels, fulles, raïms i flors de Merlot, de diferents terrenys i anys, de Suffolk, Nova York, i n’han analitzat el DNA dels bacteris presents mitjançant seqüenciació del 16S rRNA. Han trobat que un 40% de les espècies trobades són presents a totes les mostres de sòls i arrels, mentre que en fulles i fruits hi ha més variabilitat, i a més un 40% de les trobades en fulles i fruits també apareixen a les mostres de sòls. Tot plegat suggereix que molts dels bacteris s’originen al sòl.

En quant als tipus de bacteris presents, com veiem (Figura 4), predominen els Proteobacteris (sobretot Pseudomonas i Methylobacterium), principalment a les parts aèries de la planta. També hi han Firmicutes lògicament, i Acidobacteria i Bacteroides.

Fig 4 microbiota vineyard

Figura 4. Composició de la comunitat bacteriana, a nivell taxonómic de fílum, en mostres de diferents òrgans de la vinya i el seu sòl (Zarraonaindia et al 2015).


Encara que s’observen variacions en totes les mostres en funció de l’any (poden tenir diferents condicions climàtiques) i en funció de factors edàfics diferents (pH, C:N, humitat), com veiem (Figura 5) les anàlisis de components principals demostren que els tipus de mostres (sòl, arrels, fulles, raïms) es diferencien força bé, i mostres de mostos abans de fermentar queden semblants a les de raïms.

Fig 5 distribució grups mostres OTUs

Figura 5. Anàlisi de components principals mostrant les semblances en quant a la composició dels grups taxonòmics presents, entre tots els tipus de mostres, incloent-ne de mostos (Zarraonaindia et al 2015).


Això suggereix que la comunitat bacteriana present als raïms roman relativament estable fins al most, i si més no, més estable que les diferències entre òrgans. Al mateix temps, una part important dels representants dels fílums bacterians dels raïms vindrien del sòl. Això es pot explicar perquè en fer la verema manual els raïms sovint són situats en caixes que es deixen a terra, o bé si es fa verema mecànica, la maquinària utilitzada remou el terra i genera pols, que pot colonitzar els raïms.

Per tant, la microbiota del sòl és una font de bacteris associats a la vinya i pot tenir un paper en el most, i per tant en la vinificació, i potencialment en la formació de les característiques del terroir. Alguns d’aquest bacteris poden tenir papers no coneguts de productivitat o de resistència a malalties de la planta, o contribuir a les característiques organolèptiques del vi (Zarraonaindia et al 2015).

A banda d’això, i pensant en els microorganismes vínics, responsables de les fermentacions, com he comentat, al nostre laboratori hem pogut confirmar que als raïms hi ha algunes soques d’Oenococcus oeni i ho hem corroborat amb la detecció del seu DNA als mateixos raïms.


Bibliografia

Bae S, Fleet GH, Heard GM (2006) Lactic acid bacteria associated with wine grapes from several Australian vineyards. J Appl Microbiol 100, 712-727

Barata A, Malfeito-Ferreira M, Loureiro V (2012) The microbial ecology of wine grapes (Review). Int J Food Microbiol 153, 243-259

Bokulich NA, Joseph CML, Allen G, Benson AK, Mills DA (2012) Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine. Plos One 7, e36357

Bokulich NA, Ohta M, Richardson PM, Mills DA (2013) Monitoring seasonal changes in winery-resident microbiota. Plos One 8, e66437

Bokulich NA, Thorngate JH, Richardson PM, Mills DA (2014) Microbial biogeography of wine grapes is conditioned by cultivar, vintage, and climate. PNAS nov 25, E139-E148

Caporaso JG, Lauber CL, Walters WA, Berg-Lyons D, Huntley J, Fierer N, Owens SM, Betley J, Fraser L, Bauer M, Gormley N, Gilbert JA, Smith G, Knight R (2012) Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J 6, 1621–1624

Franquès J, Araque I, Portillo C, Reguant C, Bordons A (2015) Presence of autochthonous Oenococcus oeni in grapes and wines of Priorat in South Catalonia. Article en elaboració.

Garijo P, Lçopez R, Santamaría P, Ocón E, Olarte C, Sanz S, Gutiérrez AR (2011) Eur Food Res Technol 233, 359-365

Gilbert JA, van der Lelie D, Zarraonaindia I (2014) Microbial terroir for wine grapes. PNAS 111, 5-6

Renouf V, Claisse O, Lonvaud-Funel A (2005) Understanding the microbial ecosystem on the grape berry surface through numeration and identification of yeast and bacteria. Aust J Grape Wine Res 11, 316-327

Renouf V, Claisse O, Lonvaud-Funel A (2007) Inventory and monitoring of wine microbial consortia. Appl Microbiol Biotechnol 75, 149-164

Sieiro C, Cansado J, Agrelo D, Velázquez JB, Villa TG (1990) Isolation and enological characterization of malolactic bacteria from the vineyards of Northwestern Spain. Appl Environ Microbiol 56, 2936-2938

Verginer M, Leitner E, Berg G (2010) Production pf volatile metabolites by grape-associated microorganisms. J Agric Food Chem 58, 8344-8350

No sé ni cómo te atreves

Fotografía y esas pequeñas cosas de cada día

Pols d'estels

El bloc d'Enric Marco

Life Secrets

For my students

All you need is Biology

Blog professional sobre Biologia · Blog profesional sobre Biología · A professional blog about Biology

Rambles of a PA student

Caffeinated forays into biological imaginings.

Horitzons llunyans

Mirades distants

#4wine

Los vinos son pequeñas historias dentro de una botella y nosotras queremos contarte las nuestras

Vi·moments·persones

Un maridatge a tres bandes

SciLogs: Artificial, naturalmente

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

microBIO

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

RealClimate

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

Què Qui Com

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

Dionís de viatge a Ítaca

Experiències enoturístiques

%d bloggers like this: