Category Archives: Bacteris

Llevats vius aïllats de 3000 anys i altres històries de cèl·lules dorments

Click here for the English version: “Yeasts 3000-years-old are alive …

2 agost 2019

Fa uns mesos, cap a l’abril, l’amic arqueòleg i professor de la URV Jordi Diloli em va passar un article molt i molt sorprenent (Aouizerat et al 2019), que tot seguit passo a comentar, i del qual se n’ha fet ressò a internet (Borschel-Dan 2019).

Llevats “ressuscitats” de fa 3000 anys

El grup d’investigadors dirigit per Ronen Hazan de la Universitat Hebrea de Jerusalem van prendre mostres de 21 recipients de diversos jaciments de l’actual Israel de fa entre 2500 i 5000 anys, dels períodes persa, filisteu i els més antics de l’egipci. Els arqueòlegs creien que aquests recipients d’argila havien contingut begudes fermentades com cervesa o hidromel (Figura 1). Els recipients foren submergits en medi ric YPD, específic per a créixer llevats i altres fongs, i posats a incubar a temperatura ambient durant 7 dies. A continuació, mostres d’aquest medi foren sembrades en plaques d’agar amb el medi específic, i les colònies resultants foren aïllades per a les anàlisis posteriors (Aouizerat et al 2019).

Fig 1 pottery Hazan

Figura 1. Recipients d’argila d’on es van aïllar els llevats (Imatge de Judah Ari Gross, Times of Israel).

 

Els aïllats trobats foren 6 soques de diferents espècies de llevats, i una d’elles era de Saccharomyces cerevisiae, en concret d’un jaciment filisteu de fa 3000 anys. Evidentment, és molt sorprenent que s’hagin pogut aïllar llevats vius d’unes restes tan antigues. Per això, els autors del treball van dur a terme una sèrie d’experiments que poguessin confirmar aquest fet tan singular i que els aïllats no fossin producte d’una contaminació.

En primer lloc Aouizerat et al (2019) van demostrar que és possible aïllar llevats de recipients d’argila que han contingut cervesa o vi després d’un cert temps. Ho van fer tant amb recipients amb cervesa sense filtrar enterrats durant 3 setmanes, i també amb un altre recipient que havia contingut repetidament vi i que feia 2 anys que no s’utilitzava. Amb aquestes mostres van posar a punt la metodologia d’aïllament i en ambdós casos van aconseguir aïllar llevats, i no en van aïllar d’una mostra control amb cervesa filtrada, per tant sense llevats.

Per demostrar que els aïllats dels recipients antics ho eren perquè aquests havien contingut el líquid fermentat, van aplicar el mateix protocol amb mostres d’altres ceràmiques que era segur que no havien estat per a aquesta finalitat, i també de sediments propers als recipients. El resultat fou clarament negatiu per a aquestes mostres: només 2 llevats aïllats de 110 mostres, mentre que de les 21 mostres inicials havien aïllat les 6 soques de llevats esmentades. O sigui, que els llevats serien significativament més abundants en els recipients contenidors de begudes fermentades alcohòliques que en altres recipients arqueològics relacionats o els sediments al voltant.

Un altre argument que dóna suport a la hipòtesi dels autors d’aquest treball fou la identificació d’aquests 6 llevats. N’obtingueren el DNA total i procediren a la seqüenciació dels genomes i comparació amb les bases de dades. Dos d’ells, de l’època egípcia, foren identificats com Saccharomyces delphensis, una espècie que ha estat aïllada de figues seques africanes i que no és gens habitual en terra. Per tant, això suggereix la utilització de figues en les begudes alcohòliques d’aquests recipients. Un altre dels aïllats fou identificat com a Rhodotorula, que és un llevat contaminant freqüent en cerveses africanes. Un altre fou identificat com a Debaryomyces, llevats freqüents en cerveses tradicionals africanes de sorgo. Com he dit abans, un altre aïllat fou identificat com a Saccharomyces cerevisiae, el llevat més utilitzat per a fer vi, cervesa o pa (Figura 2). Malgrat això, la seqüència genètica d’aquest S. cerevisiae era clarament diferent de les soques més usades en l’actualitat, comercials o de laboratori, i per tant s’exclou la possibilitat d’una contaminació. I finalment, l’altre aïllat fou identificat com a Hypopichia burtonii, un llevat prèviament aïllat d’un hidromel d’Etiòpia.

Aquestes dades genètiques, junt amb la caracterització fenotípica (cinètica fermentativa i altres característiques bioquímiques) que Aouizerat et al (2019) van realitzar amb els aïllats, suggereixen que aquests llevats efectivament procedeixen d’un entorn relacionat amb les begudes alcohòliques. Fins i tot els autors van elaborar cervesa amb aquests aïllats i alguns, els Saccharomyces sobretot, van donar un resultat analític i sensorial força bo.

 

Fig 2 Saccharomyces_cerevisiae_SEM

Figura 2. Llevats Saccharomyces cerevisiae al microscopi electrònic de rastreig (MD Murtey & P Ramasamy)

 

Aouizerat et al (2019) conclouen que els aïllats són descendents dels llevats que foren utilitzats originalment en gran quantitat i en fermentacions repetides, i això hauria facilitat la seva supervivència en microambients dels porus de la matriu ceràmica d’aquests recipients, i que les microcolònies haurien seguit creixent mínimament durant mil·lennis gràcies a la humitat i nutrients residuals. Els autors fan l’analogia amb algunes cerveses artesanals on és usual que els residus dels recipients serveixin com a “estàrters” per a noves produccions.

Finalment, els autors d’aquest treball especulen que és possible aïllar microorganismes de restes arqueològiques, no només llevats, i que en el cas dels bacteris fins i tot podria ser més fàcil, donades les característiques de resistència d’alguns d’aquests, com els esporulats.

No hi ha cap treball similar previ al de Aouizerat et al (2019) ?

Com hem vist, és una troballa molt sorprenent, sens dubte. Científicament, el treball és força impecable i “aprovat” per la comunitat internacional: l’article és d’una revista d’accés obert amb prestigi (mBio, factor d’impacte 6.7), de l’American Society for Microbiology, on tots els articles són revisats per un mínim de dos experts, a banda dels editors. Els resultats que presenta l’article semblen molt ben treballats, i les conclusions estan ben raonades.

Tanmateix, per a mi segueix essent quasi increïble, i és estrany que no s’hagi trobat res semblant abans. Potser si algú altre prèviament hagués provat d’aïllar microorganismes tan antics i no se n’hagués sortit, potser no hauria publicat res i no ho sabríem ? Potser això no s’havia provat mai ? De fet, una explicació “malpensant” podria ser que els arqueòlegs tenen uns interessos i els microbiòlegs o biòlegs moleculars en tenen uns altres, i que per a aquest tipus de treball cal la col·laboració d’ambdós ?  Bé, no és ben bé així, ja que sí que hi han força treballs de microorganismes de l’antigor, però que sempre s’han enfocat a la detecció i anàlisi del DNA antic, amb la qual cosa es demostra que hi havien determinats microorganismes encara que no es procedís a aïllar-los o si més no a intentar-ho. 

Evidència de microorganismes en restes antigues gràcies al DNA

En relació als llevats, l’evidència més antiga és que se n’ha extret DNA ribosomal de Saccharomyces cerevisiae a partir de residus trobats dins gerres de vi d’Egipte de fa 5000 anys (Cavalieri et al 2003). Cal recordar que l’evidència arqueològica més antiga de producció de vi a gran escala és de fa 7400 anys al nord de les muntanyes Zagros, a l’actual Iran (McGovern et al 1986). Com sabeu, S. cerevisiae és també el llevat del pa i la cervesa, derivats dels cereals, però com que ni S. cerevisiae ni les seves espores són aèries, segurament la utilització d’aquest llevat en sucs fermentats del raïm, així com de dàtils, figues o mel, va precedir històricament el seu ús per a fer cervesa i pa (Cavalieri et al 2003). És probable que els llevats vínics que hi són de forma natural als raïms danyats (Mortimer & Polsinelli 1999) foren utilitzats per fermentar altres productes com els de cereals, i després de segles de selecció pels humans, evolucionessin en soques específiques per fermentar aliments i begudes.

Els genomes de microorganismes patògens també han estat estudiats en restes arqueològiques mitjançant les noves tècniques de seqüenciació massiva, per tal de seguir la pista a malalties infeccioses epidèmiques d’importància històrica, com la pesta negra, la tuberculosi, el còlera o la lepra (Andam et al 2016). En aquests casos lògicament les restes arqueològiques són restes humanes, com ossos, dents, copròlits o teixits momificats. D’aquesta manera per exemple, la filogènia i evolució de les soques del bacteri Yersinia pestis de la pesta negra ha pogut ser reconeguda des de restes de l’edat de Bronze (fa 5000 anys) fins les conegudes epidèmies dels segles 6è i 14è (Bos et al 2011). També és ben conegut el cas del genoma de Helicobacter pylori identificat a l’intestí de la mòmia d’Ötzi, l’home de gel dels Alps orientals, de fa 5300 anys (Maixner et al 2016).

També s’ha aïllat DNA de bacteris específics del digestiu humà, com Bifidobacterium i Bacteroides, per demostrar la presència humana en sediments arqueològics de fa 5000-12000 anys del nord est de Polònia (Madeja et al 2009).

Cal recordar que el DNA es degrada amb el temps, i de fet és més inestable que altres components cel·lulars. Aquesta macromolècula pateix espontàniament danys per oxidació, hidròlisi, i fragmentació en trossos que poden ser menors a 100 pb. La majoria de fòssils o altres restes biològiques de més d’uns 100.000 anys ja no contenen DNA amplificable (Hofreiter et al 2001), encara que sembla que si les mostres són extretes de sediments congelats, amb temperatures constants sota zero com els suara comentats, el DNA podria ser recuperat de fins a 400.000 anys o una mica més (Willerslev et al 2003). A més els teixits són colonitzats amb el temps per fongs i bacteris que redueixen en gran manera la quantitat relativa de molècules endògenes i poden contribuir a donar falsos positius. El risc de contaminació és molt alt i sovint aquesta es menysté. Generalment el DNA de l’hoste que s’analitza pot ser menys del 1% del DNA total trobat. Tots aquests factors compliquen l’extracció de DNA, la construcció de llibreries de seqüències, l’alineament de DNAs i l’anàlisi de genomes (Andam et al 2016).

Sorprenentment, hi ha uns quants treballs publicats on troben DNA antic de plantes, animals i diversos microorganimes, d’alguns milions d’anys (Ma), fins i tot centenars de Ma. Destaquen els obtinguts de mostres d’ambre de 20-40 Ma, i els obtinguts de sal de roca de 250 Ma (!!!!). Això seria comparable a la ficció del Parc Juràssic de recuperar DNA no degradat dels dinosaures d’uns 100 Ma.

Hebsgaard et al (2005) van revisar a fons tots aquests casos més espectaculars, amb la conclusió que aquests treballs pateixen de inadequats plantejaments experimentals i insuficient autentificació dels resultats. Per tant, hi ha grans dubtes de si les seqüències de DNA i en alguns casos els bacteris viables poden sobreviure aquests temps geològics tan grans.

A més, és preocupant que aquests treballs amb DNA tan antic no hagin estat replicats independentment per tal de confirmar la seva autenticitat, i que no mostressin una relació entre l’edat de la mostra i la persistència del DNA en funció dels diferents tipus de bacteris (Willerslev et al 2004). En canvi, aquests autors van estudiar la persistència del DNA al permafrost i com veiem (Figura 3) el DNA es va degradant i les quantitats són molt minses més enllà  de 100.000 anys i quasi no se’n troba passat 1 milió d’anys.

 

Fig 3 willerslev A

Figura 3. Persistència del DNA bacterià no degradat al llarg del temps (kyr, milers d’anys) mantingut al permafrost, mesurat per fluorescència (Willerslev et al 2004).

 

En analitzar els fílums bacterians d’aquests DNA, Willerslev et al (2004) observen (Figura 4) que els més persistents són els de Arthrobacter, principal representant dels Actinobacteris (gram-positius d’alt G+C), seguit dels esporulats (Bacillaceae i Clostridiaceae), i finalment els gram-negatius Proteobacteris.

 

Fig 4 willerslev D

Figura 4. Proporcions dels principals fílums bacterians (Actinobacteris en marron, Esporulats en taronja i Proteobacteris en blau) en base al DNA obtingut de mostres del permafrost, en funció del temps (kyr, milers d’anys) (Willerslev et al 2004).

 

Aquesta major persistència dels Actinobacteris no esporulats és sorprenent perquè els esporulats sempre han estat considerats com els més resistents de totes els tipus de cèl·lules. Malgrat que les endòspores tenen adaptacions especials com proteïnes que es lliguen al DNA per reduir la taxa de modificacions genètiques, no tenen metabolisme ni reparació activa i el seu DNA es degradarà amb el temps. Es desconeix el mecanisme de major resistència dels Actinobacteris, però podria haver-hi certa activitat i reparació del DNA a temperatures sota zero, i/o adaptacions relacionades amb l’estat de cèl·lules dorments (Willerslev et al 2004).

En qualsevol cas, els límits per amplificar el DNA per PCR estarien entre 400.000 anys i 1,5 Ma, per a mostres conservades sota zero, però això és molt més improbable en materials no congelats, com les mostres comentades d’ambre o sal de roca d’uns quants milions d’anys, i encara molt menys probable arribar a trobar cèl·lules viables d’aquestes mostres tan antigues (Willerslev et al 2004).

Bacteris “ressuscitats “

Alguns d’aquests mateixos treballs comentats on troben DNA d’alguns milions d’anys (Ma) són els casos més sorprenents d’haver “ressuscitat” microorganismes, bàsicament bacteris: cèl·lules viables de l’esporulat Bacillus de mostres d’ambre de 30 Ma (Cano & Borucki 1995), de Staphylococcus també d’ambre d’uns 30 Ma (Lambert et al 1998), i el cas més espectacular, de Bacillus d’una sal de roca de 250 Ma (Vreeland et al 2000). Aquest bacteri esporulat aïllat hauria estat en un ambient hipersalí del darrer Permià i atrapat a un cristall de sal, sobrevivint les espores fins a l’actualitat. Per al cas de Staphylococcus aïllat d’ambre, malgrat no ser esporulat, sembla que són bacteris molt resistents a condicions extremes, i que se n’han aïllat altres antics del permafrost i d’ambients molt secs (Lambert et al 1998). Malgrat això, la revisió de Hebsgaard et al (2005) d’aquests casos conclou que en cap d’ells es compleix el test de taxa relativa de distància molecular, on es calcula la taxa probable de mutacions en comparació a llinatges relacionats. Per tant, aquests aïllaments són discutibles i no reproduïts. A més, en el cas dels esmentats Bacillus de 250 Ma, s’ha discutit que la inclusió on eren els bacteris dins el cristall de roca podria ser resultat d’una recristal·lització posterior (Lowenstein et al 2011).

Una altra revisió sobre els rècords de preservació de microorganismes (Kennedy et al 1994) comenta casos publicats de fins a 600 Ma, senyalant que és curiós que hi ha força casos publicats de més de 1 Ma, i també de menys de 10000 anys, però en canvi hi ha molts pocs casos d’èpoques intermèdies. Aquests autors també remarquen els dubtes que plantegen els treballs amb bacteris supervivents tan antics, que segurament serien artefactes o contaminacions.

D’altra banda, més creïbles són els treballs de Abyzov et al (2006) i Soina et al (2004), que van demostrar la presència de diversos microorganismes vius, tant procariotes com eucariotes (llevats sobretot, però també algunes microalgues), en mostres del gel de l’Antàrtida que tenien alguns milers d’anys. Ho van fer mitjançant la combinació de mètodes microbiològics clàssics, com medis d’enriquiment i aïllament de colònies, junt amb microscòpia d’epifluorescència, microscòpia electrònica i tècniques moleculars i altres. Sembla que els bacteris que han trobat, gram-positius (Micrococcus) i gram-negatius (Arthrobacter), que no són esporulats, tenen cèl·lules dorments en forma de cist, que poden sobreviure mantenint la viabilitat a temperatures sota 0ºC durant alguns milers d’anys.

Tant quan es publiquen troballes de DNA geològicament antic com de cultius viables de mostres antigues, és fonamental la reproducció independent dels resultats per un altre laboratori, per excloure qualsevol contaminació del mateix laboratori. En el cas d’haver recuperat cèl·lules vives, cal demostrar la reproductibilitat de l’aïllament, seqüenciant els genomes dels cultius obtinguts en laboratoris independents a partir de la mateixa mostra, i comprovant que en ambdós casos els genomes coincideixen (Hebsgaard et al 2005).

A partir de les restes del fort romà de Vindolanda, al nord d’Anglaterra, s’han recuperat endòspores viables de Thermoactinomyces, un esporulat dels Bacillales (Unsworth et al 1977). Són de fa uns 1900 anys i les restes eren barreja d’argila amb palla i altres materials vegetals. Els autors proposen utilitzar aquests esporulats tan longeus com indicadors en estudis arqueològics.

A banda dels esporulats, hi ha uns quants grups de bacteris no esporulats per als quals s’han demostrat capacitats de resistència en anabiosi. En concret se n’han aïllat del permafrost i el sòl de la tundra de Sibèria del voltant del milió d’anys (Suzina et al 2006), al límit del que comentàvem abans (Willerslev et al 2004), força difícil de creure. Per estudiar experimentalment la formació d’aquestes formes d’anabiosi, Suzina et al van incubar diversos bacteris gram-positius, gram-negatius i algun arquea en medis pobres limitants en font de nitrogen, i després d’alguns mesos van obtenir-ne cèl·lules “dorments”. Van veure que aquestes tenen estructures de cist, amb càpsula i paret cel·lular engruixides, partícules intramembranoses i un nucleoide condensat (Figura 5). També van observar que aquests cists no tenen activitat metabòlica i aguanten factors estressants com la carència de nutrients o l’escalfament.

En estudiar els aïllats del permafrost, van confirmar que tenien estructures de cist molt semblants a les obtingudes al laboratori, amb estructures de paret multicapes de fins a 0,4 mm. De fet, aquests autors creuen que la majoria de bacteris presents al permafrost i a la tundra són en forma de cist (Suzina et al 2006).

 

Fig 5 fig2 modi Suzina

Figura 5. Seccions d’una cèl·lula vegetativa (a) de Micrococcus luteus i d’una cèl·lula cist (b) del mateix bacteri, obtinguda després de 9 mesos de cultiu en medi limitant en nitrogen. C, microcàpsula; CW, paret cel·lular; OL1, 2, 3, capes externes de la paret cel·lular; IL, capa interna de la paret; CM, membrana citoplasmàtica; N, nucleoide. La barra medeix 0.3 mm (Suzina et al 2006).

 

Altres llevats i fongs “ressuscitats”

A banda del sorprenent article de Aouizerat et al, motiu d’aquest post, hi han altres casos publicats de llevats i altres fongs “ressuscitats”, com els següents.

La chicha és com una cervesa de moresc, groguenca i una mica efervescent, elaborada i consumida per les poblacions andines des de fa alguns milers d’anys, el procés tradicional de la qual té la peculiaritat d’utilitzar l’amilasa de la saliva per convertir el midó en sucres fermentables. La fermentació tradicionalment tenia lloc en uns recipients d’argila anomenats “pondos”. Doncs a partir de les restes de pondos de la chicha de la cultura Hipia de Quito (fa 2100-2800 anys) s’han aïllat diversos tipus de llevats, sobretot Candida, Pichia i Cryptococcus (Gomes et al 2009). Curiosament, alguns d’aquests llevats s’han confirmat molecularment com Candida theae, similars a uns aïllats d’un té asiàtic contaminat (Chang et al 2012). Cal senyalar l’absència de Saccharomyces en aquestes chiches antigues, malgrat que en les actuals és un dels llevats principals, segurament provinent de les fermentacions de cervesa i vi que van portar els espanyols (Gomes et al 2009).

A partir de mostres de gel de Groenlàndia d’uns 100.000 anys (Ma et al 1999) sembla que també s’han pogut fer reviure diversos microorganismes, tant bacteris (Micrococcus, Rhodotorula, Sarcina) com llevats (Candida, Cryptococcus) i altres fongs (Penicillium, Aspergillus). Els autors també aïllen els DNAs i demostren el parentiu filogenètic dels aïllats. Un cop més, veiem com el gel proporciona un ambient estable i que facilita la conservació dels microorganismes i el seu DNA.

Raghukumar et al (2004) han recuperat viu el fong ascomicet esporulat Aspergillus i altres fongs a partir de mostres de sediments del fons marí, d’uns 5900 m de fons a la fossa de Chagos, al sud de les Maldives, a l’oceà Índic. En base a la fondària dins el sediment i els radiolaris presents, calculen que corresponen a un mínim d’uns 180.000 anys, i en alguns fins a 430.000 anys. A partir dels aïllats identificats com A. sydowii van obtenir espores que germinaven i creixien en pressió hidrostàtica equivalent a la fondària de 5000 m, i en una temperatura de 5ºC. Amb microscòpia d’epifluorescència i de camp brillant s’observen clarament les hifes del fong  i la seva relació amb les partícules del sediment (Figura 6). Sembla que la troballa d’aquests Aspergillus al fons marí és el fong més antic recuperat viu fins ara. Els autors suggereixen que la preservació hauria estat possible gràcies a l’elevada pressió hidrostàtica, junt amb la baixa temperatura.

 

Fig 6 Raghukumar Aspergillus deepsea indian

Figura 6. Fotomicrografies de sediment del fons (5900 m) de l’oceà Índic amb hifes de Aspergillus sydowii i partícules del sediment. (a) microscòpia d’epifluorescència combinada amb la de camp brillant; (b) epifluorescència (Raghukumar et al 2004).

 

Un dels treballs on es recuperen microorganismes viables més sorprenents i difícils de creure és el de Kochkina et al (2001), on aïllen un munt de fongs de tots els tipus, i bacteris, sobretot actinobacteris, a partir de mostres del permafrost de Rússia, Canadà i l’Antàrtida d’edats que arriben als 3 milions d’anys. Els autors suggereixen fins i tot que no hi ha un límit en quant a l’antiguitat possible per recuperar microorganismes viables. Aquest article ha tingut molt poc ressò, i ni tan sols és esmentat per articles posteriors com el de Raghukumar et al (2004).

Conclusions

Com hem vist, l’evidència de DNA de llevats no vius en restes antigues relacionades amb l’elaboració de vi es remunta a uns 5000 anys, a l’antic Egipte (Cavalieri et al 2003). Respecte a altres microorganismes, tenint en compte la degradació natural del DNA amb el temps, sembla que les mostres més antigues serien d’uns 400.000 anys com a molt, i en concret dels actinobacteris mantingudes en sediments congelats com el permafrost (Willerslev et al 2003). Les publicacions de recuperació de DNA de diversos bacteris de milions d’anys (fins a 600 Ma) presenten molts dubtes científics en quant a la seva versemblança i fiabilitat (Kennedy et al 1994).

En quant a llevats vius com els de 3000 anys de l’article motiu d’aquest post (Aouizerat et al 2019), sembla que llevats Candida i altres foren aïllats a partir de recipients per fer chicha d’uns 2800 anys (Gomes et al 2009), encara que aquesta referència és una revisió i el treball original no sembla haver estat publicat. Altres autors (Abyzov et al 2006; Soina et al 2004) també troben llevats vius, sense especificar quins, en mostres de gel de l’Antàrtida d’alguns milers d’anys. Més sorprenents són els aïllaments descrits de llevats i altres fongs i bacteris de mostres de gel de Groenlàndia de fa 100.000 anys (Ma et al 1999), així com els del fong Aspergillus del fons marí de l’Índic d’uns 180.000 anys (Raghukumar et al 2004).

En quant a altres microorganismes “ressuscitats”, alguns dels més fiables són els diversos bacteris del gel de l’Antàrtida d’alguns milers d’anys (Abyzov et al 2006) i les espores de Thermoactinomyces de restes romanes de 1900 anys (Unsworth et al 1977). Dels més antics, potser les formes d’anabiosi de bacteris conservades al permafrost de fa un milió d’anys (Suzina et al 2006) tindrien una certa versemblança. Curiosament, aquestes bacteris serien no esporulats però tindrien estructura de cist, amb paret multicapes i altres modificacions intracel·lulars. Les altres troballes de bacteris “ressuscitats” de més milions d’anys de l’ambre o de la sal de roca, de la mateixa manera que els seus DNA i també per això, són molt difícils de creure (Hebsgaard et al 2005).

Repensant en les formes cel·lulars de resistència i anabiosi, com les endòspores bacterianes i aquests cists suara comentats, cal recordar que els llevats, com molts altres fongs, tenen la capacitat de produir espores, en concret ascòspores ja que són ascomicets. Malgrat que aquestes tenen major capacitat de resistència que les cèl·lules vegetatives en ambients de sequedat o altres circumstàncies ambientals inhòspites i tenen una persistència en el temps, aparentment no hi ha (o no els he trobat) treballs relacionats amb la recuperació d’ascòspores de llevats a partir de mostres antigues.

El treball de Aouizerat et al (2019) no fa cap esment de les espores dels llevats, ni tan sols com a possible explicació de la supervivència d’aquests en aquestes mostres antigues. De fet, proposen que les microcolònies dels llevats als porus de la ceràmica durant aquests 3000 anys haurien seguit creixent mínimament gràcies a la humitat i nutrients residuals. Bé, no ho sabem, i tampoc si les ascòspores dels llevats hi han tingut algun paper.

Finalment, ens podem creure el que han trobat Aouizerat et al, però resta la porta oberta a investigar-ho en altres mostres arqueològiques similars, i no només pensant en cercar llevats vius, sinó també en bacteris d’altres productes fermentats, i més tenint en compte havent vist que no només els esporulats, sinó que altres podrien sobreviure, gràcies als cists o altres formes d’anabiosi no gaire conegudes com les dels actinobacteris.

 

Bibliografia

Abyzov SS et al (2006)Super-long anabiosis of ancient microorganisms in ice and terrestrial models for development of methods to search for life on Mars, Europa and other planetary bodies. Adv Space Res 38, 1191-1197

Andam CP et al (2016)Microbial genomics of ancient plagues and outbreaks. Trends Microbiol 24, 978 –990

Aouizerat T et al (2019)Isolation and characterization of live yeast cells from ancient vessels as a tool on bio-archaeology. mBio 10, 2, 1-21

Borschel-Dan A (2019)Israeli scientists brew groundbreaking “ancient beer” from 5,000-year-old yeast. The Times of Israel, 22nd may 2019.

Bos KI et al (2011)A draft genome of Yersinia pestisfrom victims of the Black Death. Nature 478, 506–510

Cano, R.J. and Borucki, M.K. (1995)Revival and identification of bacterial spores in 25- to 40-million year-old Dominican amber. Science 268, 1060–1064

Cavalieri D et al (2003)Evidence for S. cerevisiaefermentation in ancient wine. J Mol Evol 57:S226-232

Chang CF et al (2012)Candida theaesp. nov., a new anamorphic beverage-associated member of the Lodderomycesclade. Int J Food Microbiol 153, 10-14.

Gomes FCO et al (2009)Traditional foods and beverages from South America: microbial communities and production strategies. Chapter 3 in Industrial Fermentation, ed. J Krause & O Fleischer, Nova Science Publishers.

Hofreiter M et al (2001)Ancient DNA. Nature Rev Genet 2, 353–359.

Kennedy MJ et al (1994)Preservation records of micro-organisms: evidence of the tenacity of life. Microbiology 140, 2513-2529.

Kochkina GA et al (2001)Survival of micromycetes and actinobacteria under conditions of long-term natural cryopreservation. Microbiology 70, 356-364

Lambert LH et al (1998)Staphylococcus succinussp. nov., isolated from Dominican amber. Int J Syst Bacteriol 48, 511-518

Lowenstein TK et al (2011)Microbial communities in fluid inclusions and long-term survival in halite. GSA Today 21, 4-9

Ma L et al (1999)Revival and characterization of fungi from ancient polar ice. Mycologist 13, 70-73.

Madeja J et al (2009)Bacterial ancient DNA as an indicator of human presence in the past: its correlation with palynological and archaeological data. J Quaternary Sci 24, 317-321.

Maixner F et al. (2016)The 5300-year-old Helicobacter pylorigenome of the Iceman. Science 351, 162–165

McGovern PE et al (1986) Neolithic resinated wine. Nature 381:480–481

Mortimer R & M Polsinelli (1999)On the origins of wine yeast. Res Microbiol 150, 199-204

Raghukumar C et al (2004)Buried in time: culturable fungi in a deep-sea sediment core from the Chagos Trench, Indian Ocean. Deep Sea Res Part I: Oceanog Res Papers 51, 1759-1768

Soina VS et al (2004)The structure of resting microbial populations in soil and subsoil permafrost. Astrobiology 4 (3), 345–358.

Suzina et al (2006)The structural bases of long-term anabiosis in non-spore-forming bacteria. Adv Space Res 38, 1209-1219.

Unsworth BA et al (1977)The Longevity of ThermoactinomyceteEndospores in Natural Substrates. J Appl Microbiol 42, 45-52

Vreeland RH et al (2000)Isolation of a 250 milion-year-old halotolerant bacterium from a primary salt cristal. Nature 407, 897-900.

Willerslev E et al (2003)Diverse plant and animal DNA from Holocene and Pleistocene sedimentary records. Science 300, 791-795

Willerslev E et al (2004) Long-term persistence of bacterial DNA. Curr Biol 14,PR9-R10.

 

 

Bacteroides, els bacteris gramnegatius més abundants dins nostre

21 març 2019

Click here for the English version: Bacteroides, our most abundant gram-negative bacteria

Qui són els Bacteroides?

Bacteroides és el gènere més conegut del grup de bacteris gramnegatius més abundants dins nostre, en concret dins l’intestí. Són fins a 8·1010 per gram de femta, entre un 20 i un 40% del total de la microbiota intestinal. Per extensió, aquest grup que inclou altres gèneres relacionats, es coneixen com a bacteroidals. Són anaerobis estrictes, no esporulats, no mòbils, tenen forma de bacils amb puntes arrodonides (Figura 1), són resistents a les sals biliars, a concentració del 20% de l’intestí prim, i tenen una bona capacitat d’utilització de polisacàrids.

Fig1 Gerard F2.large

Figura 1. Micrografia electrònica de cèl·lules de Bacteroides sp. D8 (Gerard et al 2007)

Abans que res, cal senyalar que hi han excel.lents revisions de Bacteroides, com la de Wexler (2007), tant dels seus aspectes beneficiosos dins la microbiota intestinal -que aquí comentarem-, com dels aspectes tòxics i altres característiques.

Els bacteroidals viuen exclusivament al tracte gastrointestinal dels animals, i per tant mostren una gran flexibilitat per adaptar-se a les condicions nutritives de l’ambient intestinal. Com a comensals i mutualistes, estableixen associacions a llarg termini amb els hostes i els proporcionen beneficis. L’adaptació d’aquests bacteris inclou el fer modificacions d’aquest ambient, com per exemple força Bacteroides codifiquen per a una citocrom bd oxidasa, que pot reduir les concentracions d’oxigen, amb la qual cosa els és més fàcil créixer com a anaerobis estrictes que són, i de pas, altres bacteris de la microbiota habitual també en surten beneficiats (Wexler, Goodman 2017).

El substrat més usual d’aquests bacteris són els polisacàrids vegetals de la dieta i del mucus de l’hoste (Wexler, Goodman 2017). En degradar i fermentar aquests carbohidrats, apareixen com a producte principal els àcids grassos de cadena curta (AGCC). Precisament un dels principals beneficis dels bacteroidals és que són els que produeixen més propionat al tracte intestinal, i el propionat és un dels AGCC beneficiosos, junt amb l’acetat i el butirat, ja que són font d’energia per als colonòcits i contribueixen al manteniment de les correctes homeòstasis de glucosa i el metabolisme lipídic (Ríos-Covián et al 2017). També treuen cadenes laterals de les sals biliars, facilitant el retorn dels àcids biliars a la circulació hepàtica. D’altra banda, un altre aspecte beneficiós és que exclouen altres possibles patògens ja que colonitzen el tracte intestinal i no deixen establir-se a altres.

Degut al fet que el tracte intestinal dels animals és el principal hàbitat i reservori ambiental dels bacteroidals, es pensa que hi ha hagut una relació evolutiva simbiòtica entre aquests bacteris i els hostes (Troy, Kasper 2010). Com en molts altres casos evolutius, aquest comensalisme mutualístic entre els microorganismes i l’hoste és quasi una simbiosi, on pràcticament cadascun dels organismes no pot viure sense l’altre.

Com a residents habituals de l’intestí, la gran majoria de Bacteroides no són nocius, sinó al contrari, però en condicions de desequilibris metabòlics com la diabetis o en pacients quirúrgics, alguns d’ells són oportunistes i poden ser patògens, i a més, alguns tenen certa resistència a antibiòtics. De fet, B. fragilis, l’espècie més abundant a la microbiota de persones sanes, pot donar en aquests casos infeccions molt greus i és el bacteri anaeròbic patogen més important en humans (Mancuso et al 2005). L’abundància deB. fragilis és evident fins i tot pel fet que els seus bacteriòfags són utilitzats com a traçadors de matèria fecal humana en aigües (Jofre et al 1995).

 

Quin tipus de bacteris són els Bacteroides?

Tal com detalla l’apartat de Taxonomia del NCBI, el gènere Bacteroides és un bacteri del superfílum Fibrobacter-Chlorobi-Bacteroidetes. Veiem la seva relació filogenètica amb la resta de fílums bacterians a la Figura 2. El fílum Bacteroidetes inclou també Cytophaga, Flavobacter i Sphingobacter, a més de la classe Bacteroidia, que sobretot inclou l’ordre Bacteroidales. Aquest inclou 2 famílies: les Bacteroidaceae i les Prevotellaceae. A banda de Bacteroides, Prevotella és un altre dels gèneres més coneguts, que de fet abans era conegut com B. melaninogenicus. Globalment parlem de bacteroidals per referir-nos a tot l’ordre.

Fig2 Bern 12862_2004_Article_146_Fig1_HTML

Figura 2. Arbre filogenètic dels diversos grups de bacteris (Bern, Goldberg 2005)

 

Bacteroides, uns dels predominants a la microbiota intestinal humana

La microbiota intestinal humana, i dels mamífers en general, és molt complexa, però sorprenentment hi han pocs fílums que predominin. En concret, el 98% dels bacteris identificats en humans (Figura 3) són de 4 fílums: 64% Firmicutes, 23% Bacteroidetes, 8% Proteobacteria i 3% Actinobacteria. Per tant, els bacteroidals són uns dels bacteris, i per tant microorganismes, més predominants a la microbiota intestinal. De fet, com que els Firmicutes són un fílum tan gran i divers, que inclou coses tan diferents com els clostridials i els bacteris làctics, es pot considerar que els bacteroidals, com a grup molt més homogeni, són pràcticament els predominants.

Fig3 brock 767 modif

Figura 3. Composició bacteriana del còlon humà deduïda dels 16S rRNA obtinguts de 17242 seqüències de mostres fecals (Madigan et al 2012)

 

Per veure amb més detall quines són les espècies predominants de la microbiota intestinal, molt recentment s’ha fet un estudi metagenòmic i funcional de 737 genomes seqüenciats d’aïllats bacterians de mostres fecals de 20 adults britànics i nordamericans (Forster et al 2019). S’hi han detectat 273 espècies bacterianes, de les quals 105 no s’hi havien trobat abans. Com veiem (Figura 4), entre les 20 espècies dominants n’hi han 8 Bacteroides, més 2 Parabacteroides, o sigui 10, senyalades en verd. Per tant, la meitat de les espècies majoritàries són bacteroidals. Les altres 10 són 6 clostridials (Firmicutes, en blau), 3 són Actinobacteria (en groc) i 1 és Proteobacteria (en taronja).

Fig4 Forster 2019 Fig4

Figura 4. Espècies majoritàries de la microbiota intestinal humana, detectades a partir de anàlisis metagenòmiques (Forster et al 2019).

 

Encara que la microbiota és diferent segons les persones, a nivell de soca la microbiota individual és molt estable. En un estudi amb 37 persones sanes (Faith et al 2013) s’han trobat unes 200 soques de 100 espècies diferents, i el 60% de les soques romanen a cada persona en un període de 5 anys. D’aquestes que romanen, les de Bacteroidetes i Actinobacteria són els més estables.

En aquest mateix estudi (Faith et al 2013), s’han comparat les microbiotes de 6 persones d’una mateixa família i s’ha vist que entre les 75 espècies bacterianes més freqüents a tots 6 es troben 18 Bacteroidetes (24%): 11 Bacteroides, 3 Parabacteroides, AlistipesBarnesiella, Odoribacter i Butyricimonas. La única espècie de les 75 que es troba a totes 6 persones és un Bacteroides: B. vulgatus.

La microbiota que ens acompanya va canviant al llarg de la vida (Figura 5). En el cas de Bacteroides, de fet als nadons n’hi ha relativament pocs. Tanmateix, ja són part normal de microbioma de la placenta, on predominen els Proteobacteria (Aagard et al 2014). Després del part, els bacteroidals van augmentant al llarg dels primers mesos i anys, en anar deixant la llet i amb els canvis de dieta, tal com augmenta la diversitat, fins arribar als adults on Bacteroides són dels més abundants (Gómez-Gallego, Salminen 2016).

 

Fig5 GomezGallego fig 1

Figura 5. Canvis a la microbiota humana al llarg de la vida (Gómez-Gallego, Salminen 2016).

 

La ingesta de menjar sòlid als infants, entre 4 mesos i 1 any, causa un notable increment de Bacteroidetes (Figura 6). Hi veiem la gran diferència en composició microbiana que hi ha dels 118 dies als 370. Llàstima que en aquest estudi (Koenig et al 2011) no hagin pres més mostres intermèdies, on poc a poc es va passant de farinetes i una mica de cereals, a la ingesta de pèsols i altres llegums, pastanagues, patata, etc. Aquest augment dels Bacteroidetes amb el menjar sòlid segurament està relacionat amb que bacteroidals són especialistes en el trencament de polisacàrids complexes, i alhora aquests impulsen el creixement d’aquests bacteris. Al mateix temps hi ha un clar augment dels nivells d’AGCC, un enriquiment de gens de la microbiota associats amb la utilització de carbohidrats, una major biosíntesi de vitamines, i també en la degradació de xenobiòtics. Per tant, el paper dels Bacteroidetes sembla primordial en l’establiment i manteniment de la microbiota de l’adult. Si bé hi ha diferències entre individus, un cop adults la composició microbiana és força estable al llarg de la vida, però amb certes variacions en funció dels canvis de dieta o d’hàbitat o de medicacions.

Fig6 Koenig fig 3

Figura 6. Anàlisi metagenòmica de seqüències de DNA extretes de mostres fecals d’infants (Koenig et al 2011).

 

Bacteroidals als altres mamífers

La microbiota intestinal és present a tots els animals amb sistema digestiu més o menys desenvolupat. A banda dels insectes on se l’ha estudiat força (Engel, Moran 2013), els més estudiats en aquest aspecte lògicament són els mamífers. Se n’ha estudiat la seva composició (Ley et al 2008), en concret a mostres fecals de 106 individus de 60 espècies de 13 tàxons diferents, incloent primats humans i no humans, tant herbívors com carnívors i omnívors. Dels 17 fílums de bacteris trobats, eren un 65% de Firmicutes, un 16% Bacteroidetes, 8% Proteobacteris i 5% d’Actinobacteris, entre altres. Per tant, és evident la rellevància dels bacteroidals, i les proporcions són semblants a les que més amunt hem comentat per a humans. En quant al grup majoritari de Firmicutes, és una llàstima que aquest treball, com força altres, no en distingeixi els diversos grups, sobretot entre lactobacils i clostridials. En aquest treball curiosament s’observa una major presència de Bacteroides als primats i als omnívors en general, i també a alguns herbívors, que als carnívors estudiats (Figura 7). En aquests hi ha molt pocs Bacteroidetes, i en canvi hi ha més gamma-proteobacteris, probablement enterobacteris (Ley et al 2008).

Fig7 Ley fig S1A

Figura 7. Percentatges de seqüències de mostres fecals de diferents mamífers assignats als principals diferents fílums bacterians (Ley et al 2008)

 

Diferents bacteroidals són biomarcadors d’estils de vida

En la cerca de tàxons microbians que puguin ser biomarcadors de dietes o d’estils de vida, s’ha vist que en comparar persones de països rics occidentals amb les de països subsaharians, a les primeres el biomarcador més clarament relacionat és el gènere Bacteroides, mentre que als subsaharians ho és Prevotella, una altra del mateix fílum Bacteroidetes. Com veiem, aquests dos gèneres, junt amb alguns clostridials, són els gèneres més abundants.

Si la dieta majoritària a llarg termini és rica en proteïnes i greixos animals, com passa als països occidentals, predomina Bacteroides, i en canvi si la dieta és rica en carbohidrats com als països subsaharians, predomina Prevotella (Gorvitovskaia et al 2016).

 

Què passa amb Bacteroides en casos de disfuncions ?

La rellevància beneficiosa dels Bacteroides sobre la salut és patent en casos de malalties o disfuncions com les al·lèrgies o l’obesitat (Figura 8), on la diversitat de la microbiota és molt menor, i el nombre de bacteroidals (Bacteroidetes) baixa molt.

Fig9 GomezGallego fig 2

Figura 8. Canvis a la microbiota en situacions disfuncionals com al·lèrgies i obesitat. (Gómez-Gallego, Salminen 2016).

 

Bacteroides contra l’obesitat

Uns experiments molt coneguts de microbiota intestinal en relació amb l’obesitat han estat els realitzats amb ratolins sense microbiota prèvia colonitzats amb microbiota procedent de bessons humans dels quals un era obès i l’altre prim (Ridaura et al 2013), amb el resultat que els ratolins amb microbiota del bessó obès (Ob) esdevenen obesos, mentre que els de microbiota del bessó prim romanen prims (Ln) (Figura 9). A més, en els ratolins prims s’observa una major producció intestinal d’AGCC i una més gran transformació microbiana dels àcids biliars, mentre que als obesos hi ha un major metabolisme d’aminoàcids ramificats.

Com hem comentat a l’apartat anterior, en els ratolins obesos s’observa una reducció del 50% de Bacteroidetes, a banda d’un augment de Firmicutes i de metanògens (Figura 10). Com veiem els arquees metanògens disminueixen l’hidrogen produït donant metà, i el menor nivell d’hidrogen promou la fermentació per part dels Firmicutes, de l’excés de menjar ingerit.

Fig10 mice obese lean Kay Chersnush

Figura 9. Ratolins obès i prim resultants de la colonització amb microbiotes de bessons humans obès i prim, respectivament (imatge de Kay Chernush / Getty Images).

 

Fig11 brock 768 modif

Figura 10. Diferències en les comunitats microbianes intestinals entre ratolins prims (esquerra) i obesos (dreta) (Madigan et al 2012).

 

El més sorprenent però d’aquest treball (Ridaura et al 2013) és l’experiment de cohabitació dels dos tipus de ratolins Ob i Ln on s’observa que després de 10 dies de conviure junts els obesos no presenten tant greix corporal (Figura 11), i en estudiar les microbiotes per seqüenciació, es veu que hi hagut una transferència de la microbiota dels ratolins prims als obesos (Figura 12). Com veiem, els principals bacteris transferits són bacteroidals, cosa que reforça la importància d’aquests bacteris que revisem en aquest article.

Fig12 ridaura change body

Figura 11. Adipositat (% greix corporal) de ratolins obesos (Ob) i prims (Ln), i els mateixos després de 10 dies de cohabitatge a la mateixa gàbia (Obchi Lnch) (Ridaura et al 2013).

 

Fig13 ridaura ob ln bacteroi

Figura 12. Demostració de la transferència de bacteroidals (7 espècies: 5 Bacteroides, 1 Parabacteroides i 1 Alistipes) de la microbiota intestinal de ratolins prims (Lnch) als obesos (Obch) després de 10 dies de cohabitatge a la mateixa gàbia. Cada columna correspon a un ratolí (Ridaura et al 2013).

 

Bacteroides contra el colesterol

Fa molts anys que se sap que la microbiota intestinal és capaç de convertir el colesterol en la seva forma saturada, el coprostanol (Figura 13), i en el cas d’altres mamífers s’havien trobat alguns clostridials (Eubacterium) com a responsables, però en els humans no ens coneixia quins microorganismes podien fer-ho. Recentment Gérard et al (2007) han aïllat una soca de femta humana que ho fa i l’han pogut identificar com a Bacteroides, probablement una espècie propera a B.vulgatus.

Fig14 Gerard colesterol

Figura 13. Fórmules del colesterol i del coprostanol (Gerard et al 2007)

 

Els glicans (polisacàrids), importants per al mutualisme entre Bacteroides i l’hoste humà

La majoria de les macromolècules no digerides que arriben al còlon són glicans (terme pràcticament sinònim de polisacàrids), que són una part molt important de la fibra. L’únic glicà que és quasi tot digerit prèviament a l’intestí prim és el midó. El consorci de microorganismes que habiten el còlon produeix un repertori enzimàtic enorme amb la capacitat de degradar un ventall de polisacàrids complexos que l’hoste no pot processar. Per això la microbiota intestinal es refereix sovint com un òrgan metabòlic.

D’altra banda, els abundants microbis comensals de la microbiota intestinal han d’haver resistit les condicions inhòspites dels trams previs al còlon i per establir-se al còlon ho han de fer de manera que no afectin l’hoste. Per això, enlloc d’interactuar amb les cèl·lules epitelials de l’intestí, romanen a la capa de mucus externa a la superfície epitelial. Al mateix temps, aquest mucus protegeix els microbis residents dels atacs d’altres bacteris i dels bacteriòfags, i els és un substrat de nutrients. S’ha comprovat que la capacitat de subsistir en aquest ecosistema està molt relacionada amb la utilització i producció de glicans per part dels bacteris residents (Comstock 2009).

Doncs justament aquesta capacitat de relació amb els glicans és una característica important dels bacteroidals, que tal com hem vist, són els microorganismes més abundants a l’intestí, juntament amb els Firmicutes. Efectivament, els Bacteroides tenen una extensa maquinària enzimàtica per utilitzar els polisacàrids complexos presents al còlon, i els utilitzen com a font de carboni i d’energia. Aquesta gran capacitat s’ha comprovat en seqüenciar el genoma de B. thetaiotaomicron (Xu et al 2003) i veure que conté més de 80 loci d’utilització de polisacàrids que codifiquen per a proteïnes relacionades amb la detecció, importació i degradació de glicans específics del còlon.

Com veiem (Figura 14), aquests bacteroidals utilitzen tant els glicans de la dieta de l’hoste com els produïts per l’epiteli intestinal, els metabolitzen, i produeixen per un costat els beneficiosos AGCC, i d’altra banda, sintetitzen glicans que acumulen en forma d’exopolisacàrid (EPS) contribuint a formar biofilms, i en càpsules que donen senyals immunomoduladores a l’hoste (Comstock 2009). Tot plegat, es constata la rellevància dels glicans en les relacions de mutualisme entre Bacteroides i l’hoste humà.

Fig15 Comstock F1

Figura 14. Utilització i producció dels glicans (polisacàrids) per Bacteroides. IM (inner membrane): membrana citoplasmàtica; OM (outer membrane): part externa de paret cel·lular dels gramnegatius; EPS: exopolisacàrid de capes mucoses no unit covalentment, a diferència del polisacàrid capsular (Comstock 2009)

 

A més dels glicans produïts per l’hoste, alguns Bacteroides també poden utilitzar els que produeixen altres microorganismes de la microbiota, com s’ha demostrat per a B. fragilis, l’espècie més freqüent a la superfície de la mucosa intestinal, que pot metabolitzar els exopolisacàrids produïts per bifidobacteris (Ríos-Covian et al 2016). La producció d’EPS pels bifidobacteris està estimulada per la bilis. Aquesta capacitat de B. fragilis d’utilitzar el EPS dels bifidobacteris els dóna més capacitat de supervivència quan els nutrients són escassos. Al mateix temps, la degradació dels EPS pot afectar la viabilitat dels bifidobacteris, i per tant, aquests bacteroidals tindrien un paper regulador de la microbiota intestinal en general.

Alguns glicans produïts pels bacteroidals tenen un efecte beneficiós en el sistema immunològic de l’hoste. En concret, s’ha vist que el polisacàrid A (PSA) produït per B. fragilis és capaç d’activar la resposta immune dependent de cèl·lules T, que influeix en el desenvolupament i l’homeòstasi del sistema immune (Troy, Kasper 2010). En efecte, la colonització de ratolins sense microbiota (germ-free) amb B .fragilis és suficient per corregir el desequilibri previ de cèl·lules Th1 i Th2 (T helper) (Figura 15). A més, el PSA pot protegir de les colitis, com les produïdes per Helicobacter, mitjançant la repressió de citoquines proinflamatòries associades amb un altre tipus de cèl·lules T, les Th17, i altres mecanismes (Mazmanian et al 2008).

 

Fig16 Troy Fig1 PSA B fragilis

Figura 15. Impacte del polisacàrid A (PSA) de Bacteroides fragilis en el desenvolupament dels sistema immunològic mitjançant la recuperació de l’equilibri de cèl·lules Th1/Th2 (Troy, Kasper 2010).

 

La dieta pot fer que els Bacteroides contribueixin a un bon equilibri metabòlic

En relació al que he comentat dels glicans com els EPS, s’ha vist que si al medi hi ha poc N orgànic i un carboni fàcilment fermentable com la glucosa, els bacteroidals produeixen més lactat i menys propionat, i en canvi amb més nitrogen orgànic (extracte de llevat) i els polisacàrids, aquests bacteris produeixen més propionat (Ríos-Covián et al 2017). Quan els EPS són presents, com a carbohidrats més complexos i lents de fermentar, el carboni dels aminoàcids pot ser incorporat a nivell de piruvat, i aleshores la via cap a succinat i propionat està potenciada i es manté millor l’equilibri redox. Com que una major producció de propionat és beneficiosa per a l’hoste, aquests autors conclouen que en casos de disfuncions metabòliques de l’hoste, un disseny d’una bona dieta (carbohidrats complexos amb nitrogen orgànic) contribuiria a modificar l’activitat metabòlica de Bacteroides, i aquests a més d’interactuar amb els altres bacteris beneficiosos, ajudarien a promoure efectes saludables a l’hoste.

 

Bacteroides com a probiòtics ?

La EFSA (Autoritat Europea per a la Seguretat Alimentària) no ha acceptat pràcticament cap al·legació d’efectes positius dels probiòtics sobre la salut a causa dels requeriments restrictius dels estudis amb humans. El mecanisme d’acció dels probiòtics és soca-dependent i sovint no es coneix prou bé. A més, podria ser que els bacteris incorporats no produïssin canvis mesurables suficients en individus sans com per obtenir una al·legació d’efecte sobre la salut. Calen més estudis a nivell genètic, perfil de resistència a antibiòtics i criteris de selecció del probiòtic.

Els probiòtics tradicionals són sobretot Lactobacillus, Bifidobacterium, però també algunes soques d’altres bacteris làctics, i de Bacillus, d’E. coli i de Saccharomyces. A banda d’aquests, recentment s’estan introduint els anomenats probiòtics de nova generació, gràcies sobretot a les noves tècniques de cultius i de seqüenciació. Entre aquests nous possibles probiòtics destaquen el verrucomicrobial Akkermansia muciniphila, alguns clostridials (vegeu el meu post) com Faecalibacterium prausnitzii, principal productor de butirat, però naturalment també els bacteroidals. Aquests tenen a més un clar avantatge sobre els clostridials i altres Firmicutes, que són molt més estables al tracte intestinal al llarg de la vida de la persona (Faith et al 2013).

Com hem vist, essent uns dels microorganismes més abundants a la nostra microbiota intestinal, Bacteroides té generalment uns clars beneficis per a l’hoste, dels quals ja hem vist alguns, com l’obesitat, o el colesterol. Els transplantaments de microbiota fecal per a casos de diarrees associades amb infeccions de Clostridium difficile estan tenint èxit (Van Nood et al 2013) i per tant s’està veient la possibilitat d’utilitzar alguna soca concreta o diverses, i amb això els Bacteroides són uns clars candidats per la seva abundància en les mostres de microbiota fecal.

A més dels esmentats, altres beneficis dels Bacteroides són els relacionats amb el sistema immune, a nivell de citoquines i de cèl·lules T i desenvolupament d’anticossos, per tal de tractar colitis intestinals, disfuncions immunes, desordres del metabolisme i fins i tot prevenció del càncer (Tan et al 2019).

A banda dels beneficis demostrats per a l’hoste, per ser considerada probiòtica una soca bacteriana ha de tenir un estatus de seguretat sense ambigüitats. En el cas de Bacteroides, recentment s’ha estudiat una soca (DSM 23964) de B. xylanisolvens aïllada de femta d’humans sans que pot ser probiòtic i de la qual s’ha demostrat que no té determinants de virulència que s’han trobat en alguns Bacteroides oportunistes, com l’absència d’enterotoxina bft i d’activitats enzimàtiques biodegradadores de matriu extracel·lular i de PSA. Tampoc té resistència a força antibiòtics -tanmateix sí que és resistent a alguns- i no s’hi han detectat plasmidis, amb la qual cosa fa molt improbable la transferència de possibles resistències. Per tant, aquesta soca sembla ben segura (Ulsemer et al 2012a). També s’ha vist que no s’adhereix a les parets de l’intestí, però resisteix l’acció dels enzims gàstrics i el baix pH. A més, tal com indica el nom de l’espècie, degrada xilà i altres pectines, la qual cosa lliga amb l’efecte positiu que tenen els prebiòtics, o sigui aquests compostos, en aquest cas heteropolisacàrids, que són beneficiosos per a la microbiota intestinal.

Altres característiques bàsiques de probiòtic trobades en aquesta soca són la producció d’AGCC i les propietats immunomoduladores. Aquestes propietats i la seguretat i bona tolerància d’aquesta soca de B. xylanisolvens s’han comprovat incorporant-la, inactivada per calor, en una llet fermentada que en assajos ha estat ingerida per humans sans (Ulsemer et al 2012b). La seva seguretat també s’ha confirmat en estudis de toxicitat en ratolins, on altes dosis de la soca no han donat efectes tòxics ni mutagènics, ni danys hematològics ni histopatològics (Ulsemer et al 2012c).

En base a aquests estudis, l’Autoritat Europea de Seguretat Alimentària ha donat el vist-i-plau a la utilització de les llets fermentades amb B. xylanisolvens DSM 23964 pasteuritzat com a nou aliment (EFSA 2015). Tanmateix, no hi ha sol·licitud de considerar-la com a probiòtic, sobretot pel fet que els bacteris no són viables ja que s’ha pasteuritzat el producte, i per definició, els probiòtics han de ser microorganismes vius.

 

Perspectives

Hem vist la rellevància de Bacteroides com un dels components principals de la microbiota intestinal humana i de mamífers en general. A més del seu paper fonamental dins l’intestí, i de les possibilitats de la seva utilització com a probiòtic, cal afegir que és un model ideal per a l’estudi dels bacteris intestinals, a més de la seva abundància, perquè és relativament fàcil de cultivar, i té possibilitats de ser manipulat genèticament (Wexler, Goodman 2017). Per tant, cal aprofundir en el coneixement dels bacteroidals, i en particular de com metabolitzen els nutrients o el mucus de l’hoste, o com responen als canvis de dieta de l’hoste i altres pertorbacions, o com interactuen amb els altres microorganismes presents al digestiu. Una millor comprensió de tots aquests mecanismes afavorirà el disseny de terapèutiques dirigides per modificar la microbiota de pacients que pateixen diverses malalties, infeccions i desordres metabòlics lligats a la microbiota intestinal (Wexler, Goodman 2017).

 

Bibliografia

Aagaard K(2014)The placenta harbors a unique microbiome. Sci Transl Med6, 237ra65

Bern M, Goldberg D (2005)Automatic selection of representative proteins for bacterial phylogeny. BMC Evolut Biol 5:34

Comstock LE (2009)Importance of glycans to the host – Bacteroidesmutualism in the mammalian intestine. Cell Host & Microbe 5, 522-526

EFSA, European Food Safety Authority (2015)Scientific opinion on the safety of “heat-treated milk products fermented with Bacteroides xylanisolvensDSM 23964″ as a novel food. EFSA J 13(1):3956

Engel P, Moran NA (2013)The gut microbiota of insects – diversity in structure and function. FEMS Microbiol Rev 37, 699-735

Faith JJ et al (2013) The long-term stability of the human gut microbiota. Science 341, 1237439

Forster et al (2019)A human gut bacterial genome and culture collection for improved metagenomic analyses. Nature Biotechnol 37, 186-192

Gérard P et al (2007)Bacteroidessp. strain D8, the first cholesterol-reducing bacterium isolated from human feces. Appl Env Microbiol 73, 5742-5749

Gómez-Gallego C, Salminen S (2016)Novel probiotics and prebiotics: how can they help in human gut microbiota dysbiosis ? Appl Food Biotechnol 3, 72-81

Gorvitovskaia A et al (2016)Interpreting Prevotellaand Bacteroidesas biomarkers of diet and lifestyle. Microbiome 4:15, 1-12

Jofre J et al (1995)Potential usefulness of bacteriophages that infect Bacteroides fragilis as model organisms for monitoring virus removal in drinking water treatment plants. Appl Environ Microbiol 61, 3227-3231

Koenig JE et al (2011)Succession of microbial consortia in the developing infant gut microbiome. PNAS 108, 4578-4585

Ley RE et al (2008)Evolution of mammals and their gut microbes. Science 320, 1647-1651

Madigan MT, Martinko JM, Stahl DA, Clark DP (2012) Brock Biology of Microorganisms. 13th Ed. Pearson

Mancuso G et al (2005)Bacteroides fragilis– derived lipopolysaccharide produces cell activation and lethal toxicity via Toll-like receptor 4. Infect Immunity 73, 5620-5627

Mazmanian et al (2008)A microbial symbiosis factor prevents intestinal infammatory disease. Nature 453, 620-625

Ridaura VK et al (2013)Gut microbiota from twins discordant for obesity modulate metabolism in mice. Science 341, 1241214

Ríos-Covian et al (2016)Bacteroides fragilismetabolises exopolysaccharides produced by bifidobacteria. BMC Microbiol 16, 150

Ríos-Covian et al (2017)Shaping the metabolism of intestinal Bacteroidespopulation through diet to improve human health. Front Microbiol 8, 376

Tan H et al (2019)Investigations of Bacteroides spp., towards next-generation probiotics. Food Res Internat 116, 637-644

Troy EB, Kasper DL (2010)Beneficial effects of Bacteroides fragilispolysaccharides on the immune system. Front Biosci 1, 15:25-34.

Ulsemer P et al (2012)aPreliminary safety evaluation of a new Bacteroides xylanisolvensisolate. Appl Env Microbiol 78, 528-535

Ulsemer P et al (2012)bSafety and tolerance of Bacteroides xylanisolvensDSM 23964 in healthy adults. Benef Microb 3, 99-111

Ulsemer P et al (2012)cSafety assesment of the commensal strain Bacteroides xylanisolvensDSM 23964. Regul Toxicol Pharmacol 62, 336-346

Van Nood E (2013)Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. New Eng J Medicine 368, 407-415

Wexler HA (2007) Bacteroides: the Good, the Bad, and the Nitty-Gritty. Clin Microbiol Rev 20, 593-621

Wexler AG, Goodman AL (2017)An insider’s perspective: Bacteroides as a window into the microbiome. Nat Microbiol 2, 17026

Wikipedia contributors. Bacteroides [Internet]. Wikipedia, The Free Encyclopedia, 2019 March 19

Xu J et al (2003)A genomic view of the human – Bacteroides thetaiotaomicronsymbiosis. Science 299, 2074-2076

 

 

Bacteris que “mengen” plàstic

27 novembre 2018

Click here for the English version: Plastic-eating bacteria

Oceans de plàstic

Els humans estem destrossant el planeta Terra. A banda del canvi climàtic (que encara hi han ignorants que no s’ho creuen), l’exhauriment dels recursos naturals i l’extinció massiva d’espècies animals i vegetals, un dels efectes més “vistosos” és el cobriment del planeta amb deixalles. Com que el 71% de la superfície és marina, la majoria dels residus que no es degraden acaben al mar, i com sabeu, als oceans ja hi ha grans extensions cobertes de residus surants, sobretot plàstics, anomenades “illes de plàstic” (Figura 1). En el cas de la zona centre nord del Pacífic, on conflueixen diferents corrents marines, la “illa” arriba a fer 1500 km de radi, i amb plàstics fins a 200 m de fondària, i segueix creixent. Podeu llegir-ne més, i sobre les conseqüències ambientals, a l’article Sopa de plàstic del Pacífic de la Wikipedia.

F1 great-pacific-garbage-patch

Figura 1. Petita part de la illa de plàstic del Pacífic nord (Tret de oceanandreserveconservationalliance.com)

 

Els plàstics PET

Encara que hi molts tipus de plàstics, un dels més utilitzats i més abundant a les deixalles i a les “illes de plàstic” és el politereftalat d’etilè (o polietilè terfetalat), conegut com a PETo PETE (Figura 2). És un tipus de polímer termoplàstic, vulgarment plàstic, que pertany als denominats polièsters, i s’obté per síntesi a partir del petroli. És innocu, molt resistent i lleuger i té múltiples aplicacions (Figura 3). Només d’ampolles de PET per a begudes refrescants es calcula que se’n venen al món 1 milió per minut. És un material reciclable (vegeu Pet bottle recycling a Wikipedia) però molt resistent a la biodegradació. A la natura pot durar alguns centenars d’anys.

F2 PET molecular structure

Figura 2. El PET, politereftalat d’etilè.

 

F3 pet uses www.technologystudent.com

Figura 3. Les múltiples aplicacions del PET (Tret de http://www.technologystudent.com).

 

El bacteri Ideonella sakaiensis es “menja” el PET

I. sakaiensis (Figura 4) és un bacteri en forma de bacil, gram-negatiu no esporulat aeròbic heteròtrof, mòbil amb un flagel, i catalasa (+) i oxidasa (+) (Tanasupawat et al 2016). Creix a pHs neutres i és mesòfil, amb òptim a 30-37ºC. Pertany al grup filogenètic dels betaproteobacteris, que inclou entre molts altres als coneguts Neisseria (gonorrea i meningitis) i el nitrificant Nitrosomonas.

F4 Ideonella-sakaiensis falsecolorSEM Yoshida S

Figura 4. Ideonella sakaiensis, imatge al microscopi electrònic de rastreig en fals color (Treta de Yoshida et al 2016).

 

La soca201-F6, la primera de la nova espècie I. sakaiensis, fou aïllada d’un abocador i identificada el 2016 per un grup japonès de l’Institut de Tecnologia de Kyoto que cercaven bacteris que utilitzessin el plàstic com a font de carboni, a partir de mostres de restes d’ampolles de PET (Yoshida et al 2016). Van veure que aquest bacteri s’adhereix a un film de PET de baix grau i el pot degradar, mitjançant dos enzims que van caracteritzar: una PETasa i una MHETasa, que acaben donant com a productes àcid tereftàlic i etilenglicol (Figura 5), que són substàncies ambientals benignes i que el bacteri pot metabolitzar. Una colònia de I. sakaiensis va degradar del tot una ampolla de PET de baix grau en 6 setmanes. Els productes PET d’alt grau requereixen ser escalfats per afeblir-los abans que el bacteri pugui degradar-los. Aquest és el primer bacteri trobat com a degradador de PET, i l’utilitza com a única font de carboni i d’energia. Donat que el PET només existeix des de fa 70 anys, aquest bacteri hauria d’haver evolucionat en aquest breu període fins arribar a poder-lo degradar en poques setmanes, enlloc dels centenars d’anys a la natura (Sampedro 2016).

F5 Yoshida fig 3 right

Figura 5. Ruta metabòlica prevista de la degradació de PET per I. sakaiensis: la PETasa extracel·lular hidrolitza el PET donant monohidroxietil tereftàlic (MHET) i l’àcid tereftàlic (TPA). La MHETasa hidrolitza el MHET a TPA i etilenglicol (EG). El TPA és incorporat mitjançant un transportador de TPA (TPATP) i és catabolitzat a ciclohexadiè i aquest a protocatecuïc (PCA) per la DCDDH. Finalment, l’anell del PCA és tallat per una PCA 3,4 dioxigenasa amb oxigen, com és conegut a la degradació dels compostos fenòlics i altres xenobiòtics. Els n. entre parèntesis són els ORF dels gens corresponents (Tret de Yoshida et al 2016).

 

Només es coneixien prèviament alguns microfongs tropicals (Fusarium solani) degradadors del PET, que també excreten esterases. En aquest cas, aquests Fusarium serien utilitzats per modificar el teixit de polièster, per aconseguir teixits més hidrofílics i més fàcils de treballar (Nimchua et al 2008). Cal recordar l’assemblança estructural dels teixits de PET, roba de fibra sintètica (Figura 3), als de fibra natural com el cotó, ja que aquests contenen cutina, que és un polièster de les parts externes de les plantes. Per tant, els enzims de Fusarium o Ideonella deuen ser relativament semblants als que ja hi eren a la natura molt abans d’inventar-se els plàstics.

 

Recent millora genètica de l’enzim PETasa de Ideonella sakaiensis

Per tal d’entendre millor el funcionament i l’especificitat de la PETasa, recentment un grup d’investigadors nord-americans i britànics han caracteritzat l’estructura de la PETasa (Austin et al 2018), sobretot per cristal·lografia de raigs X d’alta resolució, comparant-la amb una cutinasa homòloga, obtinguda de l’actinobacteri Thermobifida fusca. Les principals diferències entre les dues han estat una major polarització en la superfície de la PETasa (pI 9.6) que en la cutinasa (pI 6.3), i per altra banda, com veiem (Figura 6), una amplada més gran de la fissura del lloc actiu en el cas de la PETasa de I. sakaiensis. Això podria ser per acomodar-hi més fàcilment els polièsters aromàtics com el PET.

F6 austin fig 2 modif

Figura 6. Estructures comparades (esquerra) de la PETasa de I. sakaiensis (dalt) i de la cutinasa de l’actinobacteri Thermobifida fusca (baix), obtingudes per cristal·lografia de raigs X d’alta resolució (0.92 Å). La fissura del lloc actiu està senyalada amb un cercle puntejat vermell. Detalls (dreta) del lloc actiu amb diferents amplades de la fissura a la PETasa de I. sakaiensis (dalt) i de la cutinasa de T. fusca (baix) (Tret de Austin et al 2018).

 

Amb la hipòtesi que l’estructura d’aquest lloc actiu de la PETasa hauria resultat de l’evolució d’una semblant a la cutinasa en un ambient amb PET, Austin et al (2018) van procedir a fer mutacions en el lloc actiu de la PETasa per fer-lo més semblant al de la cutinasa i van obtenir un doble mutant S238F/W159H que teòricament faria més estreta l’entrada del lloc actiu (Figura 6). Però la seva sorpresa va ser majúscula quan van veure que el mutant degradava millor el PET (una millora del 20%), amb una erosió del film de PET (Figura 7 C) encara més gran que la PETasa original (Figura 7 B). Van veure que l’explicació era que els canvis de residus (aminoàcids) del mutant afavorien l’encaix del PET al lloc actiu, malgrat fer-ne la fissura més estreta (Austin et al 2018).

F7 austin fig 3 modif

Figura 7. Imatges de microscòpia electrònica de rastreig d’un retall de PET sense microorganismes (A), amb incubació 96 h de la PETasa de la soca I. sakaiensis 201-F6 (B) i de la PETasa del doble mutant S238F/W159H (C) (Tret de Austin et al 2018).

 

A més, aquests autors han vist que aquesta PETasa degrada també altres polièsters semiaromàtics semblants, com el poletilè-2,5-furandicarboxilat (PEF), i per tant aquest enzim pot ser considerat una poliesterasa aromàtica, però no degrada els alifàtics.

La conclusió del seu treball és que l’enginyeria de proteïnes és factible per millorar el rendiment de la PETasa i que cal seguir aprofundint en el coneixement de les relacions entre estructura i activitat per a la biodegradació dels polièsters sintètics (Austin et al 2018).

 

Altres menja-plàstics ?

La descoberta de I. sakaiensis ha tingut molta importància per la possibilitat d’establir un procés de reciclat ràpid del PET, però no és el primer organisme que s’hagi trobat com a consumidor de plàstics. Per cert, veiem les fórmules dels principals plàstics derivats del petroli a la Figura 8.

F8 Shah 2008 Fig 1

Figura 8. Fórmules dels plàstics derivats del petroli més usuals: polietilè (PE), clorur de polivinil (PVC), polipropilè (PP), poliestirè (PS), politereftalat d’etilè (PET o PETE) i poliuretà (PU) (Tret de Shah et al 2008).

 

Doncs bé, repassant la bibliografia, veiem que s’han descrit força casos de microorganismes degradadors de plàstics (Shah et al 2008), sobretot de polietilè, poliuretà i PVC: diversos PseudomonasRhodococcus i Comamonas entre els bacteris, i alguns Penicillium, Fusarium i Aspergillus entre els fongs.

Entre els degradadors de poliuretà destaquen els fongs (Howard 2002), i sobretot l’endòfit de plantes Pestalotiopsis microspora, que pot consumir poliuretà com a única font de carboni (Russell et al 2011).

D’altra banda, és força coneguda la capacitat dels cucs o larves dels escarabats de la farina, els Tenebrio molitor, per mastegar i degradar l’espuma de poliestirè (Yang et al 2015). Alimentades només amb el PS, aquestes larves el degraden completament en uns temps relativament curts. La degradació del PS, com era d’esperar, la fan els bacteris intestinals de l’animal (Figura 9), com s’ha demostrat en aturar-se la degradació quan s’administra antibiòtic a la larva (Yang et al 2015). Un dels bacteris aïllats que s’ha demostrat degradador del PS és Exiguobacterium, un bacil·lal, però no és l’únic. De fet, en fer estudis de metagenòmica de l’intestí de les larves quan mengen PS, s’ha trobat una gran varietat de bacteris, i que aquests varien en funció del plàstic, ja que també s’ha vist la degradació de polietilè. Alguns dels bacteris amb DNA trobat com a predominant serien els enterobacteris Citrobacter i Kosakonia. Sembla que la microbiota intestinal de Tenebrio es modifica i adapta als diferents plàstics ingerits (Brandon et al 2018).

F9 fig Abs Yang 2015 2

Figura 9. Biodegradació del poliestirè pels bacteris intestinals de Tenebrio, el cuc de la farina (Yang et al 2015).

 

Per acabar, com veiem la biodegradació microbiana de plàstics en principi no biodegradables o recalcitrants no ens hauria d’estranyar, ja que per un costat, hi ha “plàstics” naturals com el polihidroxibutirat o l’àcid polilàctic que són fàcilment degradables (Shah et al 2008), i d’altra banda la capacitat adaptativa dels microorganismes per poder arribar a trencar els enllaços químics més recalcitrants és molt gran. Els microbis evolucionen ràpidament, i adquireixen estratègies millors per poder trencar els plàstics fets pels humans (Patel 2018). Ho hem vist en aquest cas de la degradació del PET, que en menys de 70 anys que fa que existeix, alguns microbis ja han trobat la manera d’aprofitar-lo.

El problema segueix sent que estem generant massa quantitat de residus plàstics en molt poc temps i els microorganismes no han tingut temps encara per poder degradar-los. És evident que haurem d’ajudar als nostres companys microbis, no generant més polímers tan poc degradables, i reciclant-los i degradant-los, entre altres maneres, utilitzant aquests mateixos microbis degradadors.

 

Bibliografia

Austin HP et al (2018) Characterization and engineering of a plastic-degrading aromatic polyesterase. Proc Nat Acad Sci 115, 19, E4350-E4357

Brandon AM et al (2018) Biodegradation of Polyethylene and Plastic Mixtures in Mealworms (Larvae of Tenebrio molitor) and Effects on the Gut Microbiome.Environ Sci Technol 52, 6526-6533

Griggs MB (2017 april 24) These caterpillars chow down on plastic bags. Popular Science. http://www.popsci.com

Howard GT (2002) Biodegradation of polyurethane: a review. Int Biodeterior Biodegrad 42, 213-220

https://en.wikipedia.org/wiki/Great_Pacific_garbage_patch

https://en.wikipedia.org/wiki/PET_bottle_recycling

https://en.wikipedia.org/wiki/Polyethylene_terephthalate

Patel NV (2018 april 17) Scientists stumbled upon a plastic-eating bacterium – then accidentally made it stronger. Popular Science. http://www.popsci.com

Russell JR et al (2011) Biodegradation of polyester polyurethane by endophytic fungi. Appl Environ Microbiol 77, 17, 6076-6084

Sampedro J (2016 marzo 10) Descubierta una bacteria capaz de comerse un plástico muy común. El País

Shah AA et al (2008) Biological degradation of plastics: a comprehensive review. Biotechnol Adv 26, 246-265

Tanasupawat et al (2016) Ideonella sakaiensis sp. nov., isolated from a microbial consortium that degrades poly(ethylene terephtalate). Int J Syst Evol Microbiol 66, 2813-2818

Yang et al (2015) Biodegradation and mineralization of polystyrene by plastic-eating mealworms: Part 2. Role of gut microorganisms. Environ Sci Technol 49, 12087-12093

Yoshida et al (2016) A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate). Science 351,1196–1199

 

 

 

Els bacteris làctics de les cerveses: els dolents i els bons

18 agost 2018

Click here for the English version: The good and the bad lactic acid bacteria of beers

No és fàcil “viure” a la cervesa

En principi, la majoria de bacteris làctics (BL), i molts altres bacteris i en general molts microorganismes, no ho tenen fàcil per sobreviure dins la cervesa, ni a d’altres begudes alcohòliques com el vi. Com és conegut, això és un dels motius principals pel qual vins i cerveses hagin estat des de l’antigor una de les maneres més segures higiènicament de beure una cosa semblant a l’aigua i que no estigués contaminada, a banda de les aigües bullides, com el té i altres infusions d’herbes.

Els motius de la difícil supervivència dels microorganismes a la cervesa són l’etanol, el pH força àcid (al voltant de 4), l’escassesa de nutrients degut a què els llevats els han assimilat quasi tots, el poc oxigen dissolt, l’alta concentració de carbònic (un 0.5% en pes/volum) i la presència dels compostos derivats de la humulona (Figura 1) del llúpol: els iso-alfa-àcids, fins a 50 ppm, que són microbicides. Tots aquests obstacles fan molt difícil que qualsevol microorganisme hi pugui prosperar. Les cerveses més susceptibles de creixement microbià no desitjat són les que algun dels obstacles o impediments esmentats està esmorteït: cerveses amb pH més alt de 4.5, o amb poc etanol o poc CO2, o amb sucres afegits -que són nutrients-, o amb poca quantitat dels compostos derivats del llúpol (Vriesekoop et al 2012).

 

Fig 1 512px-S-Humulone_Isomerization.svg

Figura 1. La humulona (esquerra) del llúpol es degrada durant l’elaboració de la cervesa a isohumulona (dreta) i altres iso-alfa-àcids, compostos amargs característics i microbicides (Wikipedia; Sakamoto & Konings 2003)

 

El pH àcid de la cervesa (lleugerament superior al vi) inhibeix molts dels bacteris patògens més coneguts (Figura 2). I els casos que veiem que podrien créixer a aquest pH a prop de 4, són inhibits pels altres factors com l’etanol.

Fig 2 Menz 2009 jib49-fig-0002-m

Figura 2. Marges de pH àcid per al creixement de diversos bacteris, comparat amb el pH típic de les cerveses. Tret de Menz et al (2009).

 

Els bacteris làctics dolents a la cervesa

Malgrat el que acabem de veure, alguns bacteris -concretament alguns dels làctics- han estat capaços d’adaptar-se evolutivament a les condicions estrictes de les cerveses, i hi poden sobreviure i espatllar-les. En concret, les espècies més freqüents com perjudicials per a la qualitat de les cerveses són Lactobacillus brevis i Pediococcus damnosus (Figura 3). La primera és la més freqüent, i pot donar gustos i aromes no desitjats, així com terbolesa al producte final. P. damnosus té l’avantatge de créixer a baixes temperatures, i pot produir també aromes no volguts, destacant-ne el diacetil (Vriesekoop et al 2012). Alguns Pediococcus i Lactobacillus poden adherir-se als llevats, induint que sedimentin, la qual cosa retarda la fermentació (Suzuki 2011).

 

Fig 3 brevis i pedio

Figura 3. Lactobacillus brevis (esquerra) i Pediococcus damnosus (dreta) al microscopi electrònic de rastreig.

 

Alguns Pediococcus també poden ser els responsables de l’aparició d’amines biògenes en algunes cerveses, amb risc per al consumidor. Les amines en certa concentració són tòxiques, poden ser presents en alguns aliments fermentats com formatges, embotits i begudes alcohòliques com vins i cerveses, i es produeixen per descarboxilació d’aminoàcids per part dels BL. El nivell de tiramina i altres amines ha estat utilitzat com a mesura de la qualitat en algunes de les cerveses belgues elaborades amb BL (Loret et al 2005).

A banda d’aquests BL, altres bacteris relacionats amb problemes de contaminació a les cerveses són els acètics com Acetobacter, típicament associats amb l’entrada d’oxigen  a l’envasat o a la distribució. Altres bacteris perjudicials són alguns enterobacteris, com Shimwellia pseudoproteus o Citrobacter freundii, que proliferen a les primeres etapes de fermentació, i produeixen butanodiol, acetaldehid i altres compostos aromàtics no desitjats (Vriesekoop et al 2012). Uns altres bacteris perjudicials per a la cervesa, sobretot un cop embotellada, són Pectinatus i Megasphaera, que són anaerobis estrictes, de la família dels clostridis, i poden produir sulfur d’hidrogen i àcids grassos de cadena curta, tots ells desagradables (Suzuki 2011).

 

Els bacteris làctics bons de les cerveses

Els BL són ben coneguts per ser uns dels microbis que més beneficis aporten al camp alimentari, per una banda com a mitjà econòmic de conservar els aliments, i per altra banda per millorar-ne la qualitat i les característiques organolèptiques. Per això són els principals agents dels aliments fermentats, junt amb els llevats. Hem vist alguns dels beneficis alimentaris dels BL en altres posts d’aquest mateix blog: els formatges prehistòrics, o la microbiota de la llet materna, i fins i tot els bacteris del vi.

Així doncs, els BL també tenen el seu bon paper a la producció de les cerveses: en concret, com veurem tot seguit, en la producció de malt acidulat, i en alguns estils peculiars de cervesa com les Làmbic de Bèlgica i la Berliner Weissbier.

Com sabeu, el malt és la matèria primera per fer cerveses. El cereal és sotmès al procés del maltatge, on els grans del cereal -ordi fonamentalment- es fan germinar, els enzims hidrolitzen el midó a sucres, i tot plegat es cou a continuació, obtenint-ne el most, que és la solució substrat per tal que els llevats fermentin i produeixin l’etanol i el carbònic. L’acidificació del malt, o sigui amb un pH més baix, té els avantatges d’activar molts enzims importants al maltatge, i donar una menor viscositat al malt i per tant a la cervesa final. Encara que l’acidificació es pot aconseguir afegint-hi àcids minerals o l’àcid làctic comercial, sovint es recomana o es legisla que l’acidificació sigui biològica, la qual s’aconsegueix afegint-ne BL. La utilització de cultius iniciadors de BL és un procés relativament nou i a més dels beneficis comentats sobre la qualitat del malt, s’ha demostrat que també inhibeix floridures no desitjades que són un problema real al maltatge i que poden donar micotoxines. Els compostos produïts pels BL que poden inhibir els fongs són el mateix àcid làctic i la baixada de pH conseqüent, algunes bacteriocines, peròxid d’hidrogen, i altres compostos no gaire coneguts com potser alguns pèptids (Lowe & Arendt 2004).

Les soques de BL més utilitzades per acidular el malt són de Lactobacillus amylolyticus aïllats prèviament del mateix malt. Aquestes soques de L. amylolyticus són moderament termòfiles, resistents als compostos derivats de l’humulona, i tenen l’avantatge de ser amilolítics a banda de produir l’àcid làctic, que baixa el pH (Vriersekoop et al 2012).

Les cerveses en la fermentació de les quals intervenen BL, com les d’estils Làmbic i Berliner Weissbier, pertanyen al tipus de cerveses de fermentació espontània. Els altres tipus de cerveses de fermentació controlada són, com sabeu, les més conegudes Ale i les Lager, ambdues inoculades amb llevats específics. Les Ale són les de fermentació alta, on el llevat Saccharomyces cerevisiae utilitzat tendeix a romandre a la superfície i la temperatura de fermentació és per damunt de 15ºC i de 20ºC. Les Lager són les de fermentació baixa, originàries històricament de Baviera, on el llevat S. pastorianus (syn. S. carlsbergensis) tendeix a dipositar-se al fons del fermentador i la temperatura és entre 7 i 13ºC.

 

Les cerveses belgues Làmbic

Les cerveses belgues tradicionals d’estil Làmbic (neerlandès lambiek o lambik) són les més conegudes en quant a les seves característiques sensorials degudes a l’activitat dels BL. Són tradicionals de Brussel·les mateix i de la regió veïna de Pajottenland, a la vall de riu Zenne, al Brabant flamenc al SW de la capital belga. Un dels pobles d’aquesta vall és Lembeek, que podria ser l’origen del nom d’aquesta cervesa.

Aquestes cerveses flamenques de fermentació espontània representen l’estil més antic de fer cervesa del món desenvolupat, des de fa uns quants segles. Des de fa pocs anys se n’elaboren cerveses semblants a altres països en petites quantitats, i als EEUU des de 2008 se’n produeixen en força quantitat, les anomenades “American coolship ales” (Ray 2014).

Les cerveses làmbiques s’elaboren amb malta d’ordi i un mínim de 30% de blat no maltejat. Al most s’afegeixen els cons d’un llúpol especial, totalment assecats i envellits durant 3 anys. S’hi afegeixen no tant per al seu aroma o amargor, que justament els envellits en tenen menys, sinó com a antimicrobià, per prevenir sobretot el creixement de bacteris patògens gram-positius al brou de fermentació.

També per evitar aquests contaminants i per afavorir la microbiota pròpia de la fermentació làmbica, aquestes cerveses només es produeixen entre octubre i maig, ja que a l’estiu hi ha massa microorganismes perjudicials a l’aire que podrien espatllar la cervesa, i cal baixar la temperatura després de la bullida. L’ebullició del most es realitza de forma intensiva, amb una evaporació del 30%. Després de la bullida, el brou es deixa en dipòsits oberts, i d’aquesta manera hi són adquirits els microorganismes de l’aire presents a les sales de fermentació de la cerveseria, normalment a la part alta de l’edifici, i de l’aire exterior, ja que la tradició diu que cal deixar les finestres obertes. Se suposa que la microbiota captada és específica de la vall del Zenne. Aquests dipòsits oberts són els koelschip en neerlandès (coolship en anglès), com piscines (Figura 4). En ser ben oberts, amb molta superfície (uns 6 x 6 m) i poca fondària (uns 50 cm), afavoreixen la captació dels microbis de la sala i de l’exterior. Una altra finalitat d’aquesta forma és el refredament més ràpid del brou bullit per iniciar la fermentació. Poden ser de fusta, de coure o d’inoxidable més recentment.

DCIM100GOPROGOPR0641.JPG

Figura 4. Koelschip (en neerlandès) o coolship (en anglès), els dipòsits oberts, com piscines, on s’inicia el procés de la cervesa Làmbic (Brasserie Cantillon, Brussel·les).

 

El brou “inoculat” d’aquesta manera espontània només es deixa una nit als koelschip, i l’endemà aquest most ja es bombeja a tancs de fermentació on hi serà un any, on el contingut en sucres va baixant, fins a uns 30 g/L. Després es transfereix a barriques de roure de les utilitzades prèviament per a xerès o porto, on es pot arribar a deixar uns dos anys més, a unes temperatures de 15-25ºC. Algunes barriques fa 100 anys que s’utilitzen les mateixes. El producte final és una cervesa tèrbola, d’un groc pàl·lid, amb molt poc carbònic, seca, àcida, amb uns 6-8º d’etanol, que recorda una mica al xerès i sobretot a la sidra, i amb un regust lleugerament agre (Jackson 1999).

En aquest llarg procés de fermentació, fins a 3 anys, com és lògic, hi ha una diversitat en la composició de la població microbiana. En una primera fase hi ha una certa predominança de llevats Kloeckera i sobretot d’enterobacteris durant el primer mes. Al cap de 2 mesos ja predominen Pediococcus damnosus i Saccharomycess pp. i comença la fermentació alcohòlica. Després de 6 mesos de fermentació el llevat predominant és Dekkera bruxellensis (Spitaels et al 2014), o el que és el mateix, Brettanomyces (Kumara & Verachtert 1991), del qual Dekkera és la forma sexual.

Fig 5 Spitaels fig3

Figura 5. Espècies dels aïllats en medis d’agar MRS i VRBG, sobretot enterobacteris i bacteris làctics, al llarg del procés d’elaboració d’una cervesa làmbic. El nombre d’aïllats és entre parèntesis (Spitaels et al 2014).

 

Veiem (Figura 5) com en concret a partir dels 2 mesos el bacteri predominant és el bacteri làctic P. damnosus. Aquest fou nomenat als primers estudis com “P. cerevisiae“, però aquest nom finalment no fou admès perquè incloïa altres espècies. El recompte d’aquests en MRS és de 10UFC per mL fins al final de la fermentació. L’acidificació sembla que té lloc ràpidament en la transició de la primera fase a la de maduració, coincidint amb el creixement de P. damnosus, que produeix làctic, encara que Dekkera/Brettanomyces i els bacteris acètics també contribueixen a l’acidificació (Spitaels et al 2014).

En altres assajos amb les American coolship ales (ACA) d’estil làmbic també s’han trobat Lactobacillus spp., i en un estudi metagenòmic (Bukolich et al 2012) amb aquestes ACA s’ha detectat DNA de diversos lactobacil·lals, i al final del procés també s’observa un predomini de Pediococcus (Figura 6, panell C). A la mateixa figura al panell A observem com el fong unicel·lular predominant també és Dekkera/Brettanomyces.

Fig 6 Bukolich fig 2

Figura 6. Anàlisis TRFLP (polimorfismes de longituds de fragments de restricció terminal amplificats per PCR) de DNA total extret de mostres del procés de fermentació de cerveses ACA (similars a les làmbic) durant 3 anys, utilitzant encebadors específics per a: llevats (ITS1/ITS4 del 26S rDNA, panell A);  bacteris (16S rDNA, panell B); i bacteris làctics (panell C). Les mostres senyalades amb * no donaren amplificació. (Bukolich et al 2012)

 

Cerveses derivades de les Làmbic: Gueuze, les afruitades i altres

La làmbic bàsica, tal qual, és difícil d’aconseguir, només es troba a uns pocs cafès de Brussel·les i de la zona de producció. De fet, és la base per elaborar les altres, molt més habituals de consumir:

La Faro és una làmbic endolcida amb sucre moré i a vegades amb espècies.

Les làmbic afruitades són les que se’ls ha afegit fruites senceres o xarop de fruites. Poden ser amb cirera agre (kriek), que són les més tradicionals, o amb gerds, préssec, raïm, maduixa, i en ocasions també de poma o pinya o albercoc o altres.

I finalment, les Gueuze, que són escumoses i fàcils de trobar per al consumidor. S’elaboren barrejant làmbiques joves (de 6 mesos a 1 any) amb altres làmbiques més madures (de 2-3 anys) en ampolles de vidre gruixut semblants a les de xampany o cava i es deixen per a una segona fermentació gràcies als sucres romanents del làmbic jove. Això ho hauria començat a fer un alcalde de Lembeek cap al 1870, que era propietari d’una cerveseria i hi va aplicar les tècniques de fermentació en ampolla que feia alguns anys havien donat bon resultat a la Xampanya (Cervesa en català 2012). La paraula gueuze pot tenir el mateix origen etimològic que gist (llevat en neerlandès) i també podria referir-se a que produeix bombolles del carbònic, o sigui, gas (Jackson 1999). Tanmateix, una altra versió històrica seria que a aquesta cervesa li deien “Lambic de chez le gueux” (làmbic de cal pobre) perquè l’esmentat alcalde de Lembeek tenia idees socialistes semblants a les del “Parti des Gueus” (partit dels captaires) que van fundar els calvinistes de Flandes al segle XVI per lluitar contra l’imperi espanyol. I com que cervesa és femení en francès, el femení de gueux és gueuze, vet aquí (Cervesa en català 2012).

En aquesta refermentació en ampolla es mantenen les poblacions de Dekkera/Brettanomyces i de BL, encara que apareixen en poca quantitat altres fongs unicel·lulars com Candida, Hansenula, Pichia o Cryptococcus (Verachtert & Debourg 1999).

Fig 7 lambics3 swanbournecellars

Figura 7. Diverses cerveses Gueuze i làmbic afruitades, majoritàriament belgues (Foto de www.swanbournecellars.com.au/).

 

La Berliner Weissbier (Figura 8) és una altra cervesa relativament semblant a les Làmbic. També és una cervesa feta amb una part important de most de blat, és tèrbola, àcida i amb un 3% d’etanol. És una clàssica de Berlín i el nord d’Alemanya, elaborada des del s. XVI i que fins a finals del s. XIX era la beguda alcohòlica més popular de Berlín, i que els soldats de Napoleó anomenaven el “xampany del nord”. En la fermentació espontània del most intervenen una barreja de Dekkera/Brettanomyces, Saccharomyces i lactobacils heterofermentatius.

Fig 8 Berliner Weissbier boozedancing_Fotor

Figura 8. La cervesa Berliner Weisse (tret de G-LO, @boozedancing wordpress).

 

Cerveses tipus làmbic fetes a Espanya

De la mateixa manera que recentment es fan les comentades American Coolship Ales, també se’n fan a molts altres països i en el cas d’Espanya, coincidint amb el gust per les cerveses artesanals, també se n’elaboren de tipus làmbic, sobretot de les afruitades. Segons el portal Birrapedia, actualment se n’elaboren 6 d’aquestes, totes de cireres, de les quals dues a les terres de Lleida, una a Barcelona, una a la Marina Alta d’Alacant, una a la vall del Jerte, i una altra a Astúries.

 

Resistència dels bacteris làctics de la cervesa als compostos del llúpol

Lactobacils i pediococs, tant els dolents com els bons que hem vist, i altres bacteris contaminants de les cerveses, tenen la capacitat de resistir els compostos del llúpol, que com hem vist són microbicides naturals. Aquesta resistència pot ser deguda a diversos sistemes de defensa, tant actius com passius (Sakamoto & Konings 2003). Els actius inclouen bombes d’eflux, com HorA i HorC, que transporten els iso-alfa-àcids (Figura 1) cap a fora la cèl·lula.  HorA ho fa amb despesa d’ATP, i HorC mitjançant la força motriu de protons (Figura 9). Els gens corresponents horA i horC foren trobats originalment a L. brevis, però després s’han trobat també a L. lindneri, L. paracollinoides i el més conegut P. damnosus (Suzuki et al 2006).

Curiosament, HorA mostra una semblança del 54% amb OmrA, un transportador de membrana d’Oenococcus oeni, relacionat amb la tolerància d’aquest bacteri del vi a l’etanol i altres factors d’estrés (Bourdineaud et al 2004) (Vegeu alguna cosa més sobre O. oeni al meu post sobre els bacteris de la vinya i el vi). Per tant, és probable que HorA tingui també funcions d’exclusió d’altres compostos a banda dels del llúpol. S’ha vist que aquests gens de resistència horA i horC i les seves regions flanquejants estan molt ben conservades i tenen les seqüències quasi idèntiques a les diferents espècies que les tenen; per tant, és molt probable que unes les hagin adquirit de les altres mitjançant transferència gènica horitzontal, per plasmidis o transposons, com és usual en molts altres bacteris (Suzuki 2011).

Fig 9 brevis Suzuki fig 8

Figura 9. Mecanismes de resistència als compostos del llúpol (Hop) a Lactobacillus brevis (Suzuki 2011).

 

Com veiem a la mateixa Figura 9, els protons entrats són bombejats a fora per una ATPasa, i el consum d’ATPs és compensat formant-ne gràcies al consum de substrats com citrat, malat, piruvat o arginina. Un altre mecanisme de resistència, passiu en aquest cas, és la modificació de la composició d’àcids grassos de membrana, amb la incorporació de més saturats, com el C16:0, disminuint la fluïdesa de membrana i dificultant l’entrada dels compostos del llúpol. Això també ens recorda els canvis de membrana a O. oeni relacionats amb la resistència a etanol (Margalef-Català et al 2016). La paret cel·lular també canvia la seva composició en presència dels alfa-iso-àcids del llúpol, augmentant-ne la quantitat dels lipoteicoic d’alt pes molecular, la qual cosa també faria de barrera. Veiem també (Figura 9) com els compostos del llúpol poden fer disminuir els nivells intracel·lulars de Mn2+, i aleshores s’observa una major síntesi de proteïnes dependents de Mn i una major captació de Mn2+ de l’exterior. Finalment, les cèl·lules de L. brevis quan són a la cervesa redueixen la seva mida (Figura 10), probablement per disminuir la superfície extracel·lular, i així minimitzar l’efecte dels compostos tòxics externs (Suzuki 2011).

Fig 10 brevis mida Suzuki

Figura 10. Efectes de l’adaptació a la cervesa (esquerra) en la mida de les cèl·lules de Lactobacillus brevis en comparació a les crescudes en medi ric MRS (dreta). Les barres fan 5 µm (Suzuki 2011).

 

Tots aquests mecanismes s’han estudiat a soques de L. brevis perjudicials de la cervesa, però se suposa que la resistència que també tenen els bacteris beneficiosos de les làmbiques i altres ha de ser deguda als mateixos mecanismes, ja que són de les mateixes espècies bacterianes.

Com a conclusió de tot el que he comentat, veiem que els bacteris làctics tenen uns papers destacables com a beneficiosos en diversos aspectes de la cerveseria i malteria, malgrat el seu paper més conegut de perjudicials en l’elaboració de les cerveses més habituals.

 

Bibliografia

Birrapedia (vist 18 agost 2018) Cervezas de tipo Fruit Lambic elaboradas en España. https://birrapedia.com/cervezas/del-tipo-fruit-lambic-elaboradas-en-espana

Bokulich NA et al (2012) Brewhouse resident microbiota are responsible for multi-stage fermentation of American Coolship Ale. PLoS One, 7, e35507

Bourdineaud J et al (2004) A bacterial gene homologous to ABC transporters protect Oenococcus oenifrom ethanol and other stress factors in wine. Int J Food Microbiol 92, 1-14.

Cervesa en català (2012) Fitxes de degustació – Timmermans Gueuze Tradition http://cervesaencatala.blogspot.com.es/2012/06/fitxes-de-degustacio-timmermans-gueuze.html

Jackson, Michael (1999) Belgium’s great beers. Beer Hunter Online, july 30, 1999

Kumara HMCS & Verachtert H (1991) Identification of Lambic superattenuating micro-organisms by the use of selective antibiotics. J Inst Brew 97, 181-185

Loret S et al (2005) Levels of biogenic amines as a measure of the quality of the beer fermentation process: data from Belgian samples. Food Chem 89, 519-525

Lowe DP & Arendt EK (2004) The use and effects of lactic acid bacteria in malting and brewing with their relationships to antifungal activity, mycotoxins and gushing: a review. J Inst Brew 110, 163-180

Margalef-Català et al (2016) Protective role of glutathione addition against wine-related stress in Oenococcus oeni. Food Res Int 90, 8-15

Menz G et al (2009) Pathogens in beer, in Beer in Health and Disease Prevention, (Preedy, V. R. Ed.), 403–413, Academic Press, Amsterdam

Ray AL (2014) Coolships rising: the next frontier of sour beers in the U.S.  First we feast 27 feb 2014

Sakamoto K & Konings WN (2003) Beer spoilage bacteria and hop resistance. Int J Food Microbiol 89, 105-124

Spitaels F et al (2014) The microbial diversity of traditional spontaneously fermented lambic beer. PLOS One 9, 4, e95384

Suzuki K et al (2006) A review of hop resistance in beer spoilage lactic acid bacteria. J Inst Brew 112, 173-191

Suzuki K (2011) 125th Anniversary Review: microbiological instability of beer caused by spoilage bacteria. J Inst Brew 117, 131-155

The Beer Wench (2008) My obsession with wild beers. Nov. 20, 2008 https://thecolumbuswench.wordpress.com/tag/lambic/

Verachtert H & Debourg A (1999) The production of gueuze and related refreshing acid beers. Cerevisia, 20, 37–41

Vriesekoop F et al (2012) 125th Anniversary review: Bacteria in brewing: the good, the bad and the ugly. J Inst Brew 118, 335-345

 

Bacillus com a probiòtics

Click here for the English version: Bacillus as probiotics

4 d’agost 2017

Els probiòtics

Els probiòtics són microorganismes vius que, en ingerir-los en quantitats adequades, poden tenir algun efecte positiu sobre la salut dels hostes (FAO/WHO 2006; World Gastroenterology Organisation 2011; Fontana et al. 2013). Els hostes poden ser els humans però també altres animals. Els bacteris làctics, sobretot del gènere Lactobacillus, i els bifidobacteris, ambdós considerats com a GRAS (Generally recognized as safe, generalment reconeguts com a segurs), són els més utilitzats com a probiòtics, però altres bacteris i alguns llevats també poden ser útils. A banda de poder ser administrats com a medicaments, els probiòtics es consumeixen normalment des de fa mil·lennis com una part dels aliments fermentats, com passa amb el iogurt i altres productes làctics (vegeu el meu article “Formatge europeu de fa 7400 anys ….” 26 desembre 2012). Com a medicaments, els probiòtics generalment són venuts sense recepta, de venda lliure a les farmàcies (OTC en anglès, over-the-counter).

Ja he comentat en altres articles d’aquest blog la rellevància dels probiòtics (“Un nou probiòtic activa la microbiota contra el càncer de fetge” 13 juliol 2016), així com de la microbiota que conviu amb el nostre cos (“Bacteris controlant el que mengem” 8 set 2014 ; “Bacteris de la llet materna” 26 gener 2013) i dels altres animals (“Microbiota de la pell humana … i del gos de casa” 17 novembre 2015; “El panda gegant i la seva microbiota…” 26 agost 2015).

A banda dels bacteris làctics i els bifidobacteris, altres microorganismes que també s’utilitzen en certa mesura com a probiòtics són el llevat Saccharomyces cerevisiae, algunes soques d’Escherichia coli, i alguns Bacillus, com ara veurem. També comencen a utilitzar-se alguns clostridials, en relació al que vaig comentar en un article anterior d’aquest mateix blog pel març 2015 (“Tenim clostridis bons al budell….”).

 

Els Bacillus

De fet, els Bacillus i els clostridials tenen en comú la capacitat de formar endòspores. I tots dos grups són grampositius, dins del fílum taxonòmic Firmicutes (Figura 1), que inclou també els bacteris làctics. Tanmateix, els bacil·lals (Bacillus i altres semblants, però també estafilococs i Listeria) són evolutivament més a prop dels lactobacil·lals (els bacteris làctics) que dels clostridials. La principal diferència fisiològica entre Clostridium i Bacillus és que els primers són anaerobis estrictes i Bacillus són aerobis o facultatius.

Fig 1 tree gram + AB

Figura 1. Esquema d’arbre filogenètic dels bacteris grampositius (Firmicutes i Actinobacteris). Elaboració pròpia.

 

Les endòspores bacterianes (Figura 2) són les estructures biològiques més resistents, ja que sobreviuen als ambients inhòspits extrems, com radiacions UV i gamma, dessecació, lisozim, altes temperatures (són la referència per als càlculs d’esterilització tèrmica), falta de nutrients i desinfectants químics. Es troben al terra i a l’aigua, on poden sobreviure durant períodes de temps molt llargs.

Fig 2 bacillus Simon Cutting

Figura 2. Endòspores (les parts blanques) de Bacillus subtilis en formació (Imatge de Simon Cutting).

 

Bacillus als aliments fermentats, sobretot asiàtics

Diversos Bacillus estan implicats clàssicament en els processos de fermentació d’aliments, sobretot per la seva capacitat de producció de proteases, amb la qual cosa durant les fermentacions contribueixen a l’enriquiment nutritiu amb els aminoàcids resultants de la proteòlisi enzimàtica.

Uns d’aquests aliments són els fideus de farina d’arròs fermentada, típics de Tailàndia i Birmània. S’ha vist que en aquesta fermentació intervé una varietat de microorganismes, amb bacteris làctics, llevats i altres fongs, però també bacteris aerobis entre els que hi ha B. subtilis. S’ha trobat que l’activitat proteolítica d’aquests digereix i elimina substrats proteics de l’arròs que són al·lèrgens, com l’azocaseïna, i per tant tenen una activitat beneficiosa per a la salut dels consumidors (Phromraksa et al. 2009).

Tanmateix, l’aliment fermentat amb Bacillus més conegut és la soja fermentada alcalina. Com sabeu, la soja (Glycine max) o faves de soja, són un dels vegetals nutritius més consumits històricament, sobretot als països asiàtics. Se n’obté “llet” de soja, farina de soja, oli de soja, concentrat de soja, iogurt de soja, tofu (llet de soja quallada), i productes fermentats com la salsa de soja, el tempeh, el miso i altres. La majoria d’aquests fermentats es fan amb el fong Rhizopus, afavorint el seu creixement per acidificació o inoculant-lo directament. En canvi, si no s’acidifica i les faves de soja es deixen fermentar només amb aigua, els microbis naturals predominants que ho fermenten són Bacillus, i d’aquesta manera s’obté, entre altres, el “chongkukjang” coreà, el “kinema” de la Índia, el “thua nao” del nord de Taïlàndia, el “douchi” xinès, el “chine pepoke” birmà, i el més conegut, el “natto” japonès (Figura 3). La fermentació espontània amb els Bacillus dona amoni com a subproducte, i per això és alcalina, la qual cosa dóna una olor no gaire bona a molts d’aquests productes, però el natto s’elabora amb un cultiu seleccionat de B. subtilis que hi dóna un olor més suau i agradable (Chukeatirote 2015).

Aquests aliments són bons del punt de vista nutritiu ja que contenen proteïnes, fibra, vitamines, i tot d’origen vegetal o microbià. A més, la publicitat del natto comercial emfatitza, a banda de què és elaborat artesanalment i es ven fresc (no congelat), les seves qualitats probiòtiques, dient que els B. subtilis (Figura 4) que conté promouen la salut gastrointestinal, immunològica, cardiovascular i dels ossos (www.nyrture.com). Diuen que el sabor i la textura del natto són exquisits. Es menja amb arròs o amb altres ingredients i salses, i també dins el maki sushi. Caldrà provar-lo !

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

Figura 3. El “natto”, faves de soja fermentades amb B. subtilis, esmorzar amb arròs, típic japonès (Pinterest.com)

Fig 4 Bs nyrture-com micrograf electro colorejada

Figura 4. Micrografia electrònica colorejada de Bacillus subtilis (Nyrture.com)

 

Bacillus com a probiòtics

Justament les endòspores són el principal avantatge dels Bacillus per ser utilitzats com a probiòtics, gràcies a la seva estabilitat tèrmica i per poder sobreviure les condicions gàstriques (Cutting 2011). Si bé Clostridium també té aquest avantatge, la seva condició d’anaerobi estricte en fa més complexa la seva manipulació, a banda del “mal nom” d’aquest gènere degut a algunes conegudes espècies tòxiques d’aquest gènere.

A diferència d’altres probiòtics com Lactobacillus o Bifidobacterium, les endòspores de Bacillus poden ser emmagatzemades indefinidament sense aigua. Els productes comercials s’administren en dosis d’unes 10^9 espores per gram o per ml.

Cada cop hi ha més productes comercials de probiòtics que contenen Bacillus, tant per a consum humà (Taula 1) com per a ús veterinari (Taula 2). A més a més, també hi ha uns 5 productes específics per a aqüicultura amb diversos Bacillus, i a més sovint les granges de gambes utilitzen els de consum humà (Cutting 2011).

Per a ús en l’aqüicultura s’han obtingut productes probiòtics de barreges de Bacillus (B. thuringiensis, B. megaterium, B. polymixa, B. licheniformis i B. subtilis) aïllant-los de l’intestí de la gamba Penaeus monodon infectada de vibriosis. S’han seleccionat en base a biodegradació de nutrients i a la capacitat inhibitòria del patogen Vibrio harveyi (Vaseeharan & Ramasamy 2003) Són preparats en liòfil o microencapsulades en alginat sòdic, i s’ha comprovat que milloren significativament el creixement i la supervivència de les gambes (Nimrat et al. 2012).

Com veiem per als productes de consum humà, quasi la meitat de les marques (10 de 25) són elaborades al Vietnam. En aquest país l’ús de Bacillus probiòtics està més desenvolupat que en qualsevol altre, però els motius no estan clars. Curiosament allà, com en altres països del sud est asiàtic, no hi ha el concepte de suplements dietètics i els probiòtics com Bacillus només són venuts com a medicaments aprovats pel Ministeri de Salut. Es prescriuen per a la infecció per rotavirus (diarrea infantil) o la estimulació immunològica enfront enverinaments, o són molt freqüentment utilitzats com a teràpia contra infeccions entèriques. Tanmateix, no està clar que s’hagin fet proves clíniques i són productes fàcils de comprar (Cutting 2011).

 

Taula 1. Productes comercials de probiòtics amb Bacillus, per a consum humà (modificat de Cutting 2011).

Producte País del fabricant Espècies de Bacillus
Bactisubtil ® França B. cereus
Bibactyl ® Vietnam B. subtilis
Bidisubtilis ® Vietnam B. cereus
Bio-Acimin ® Vietnam B. cereus i 2 altres
Biobaby ® Vietnam B. subtilis i 2 altres
Bio-Kult ® Regne Unit B. subtilis i 13 altres
Biosporin ® Ucraïna B. subtilis + B. licheniformis
Biosubtyl ® Vietnam B. cereus
Biosubtyl DL ® Vietnam B. subtilis i 1 altre
Biosubtyl I i II ® Vietnam B. pumilus
Biovicerin ® Brasil B. cereus
Bispan ® Corea Sud B. polyfermenticus
Domuvar ® Itàlia B. clausii
Enterogermina ® Itàlia B. clausii
Flora-Balance ® Estats Units B. laterosporus *
Ildong Biovita ® Vietnam B. subtilis i 2 altres
Lactipan Plus ® Itàlia B. subtilis *
Lactospore ® Estats Units B. coagulans *
Medilac-Vita ® Xina B. subtilis
Nature’s First Food ® Estats Units 42 soques, incloent 4 B.
Neolactoflorene ® Itàlia B. coagulans * i 2 altres
Pastylbio ® Vietnam B. subtilis
Primal Defense ® Estats Units B. subtilis
Subtyl ® Vietnam B. cereus
Sustenex ® Estats Units B. coagulans

* Alguns etiquetats com Lactobacillus o altres bacteris porten realment Bacillus

 

Taula 2. Productes comercials de probiòtics amb Bacillus, per a ús veterinari (modificat de Cutting 2011).

Producte Animal País del fabricant Espècies de Bacillus
AlCare ® Porcs Austràlia B. licheniformis
BioGrow ® Pollastres, vedells, porcs Regne Unit B. licheniformis i B. subtilis
BioPlus 2B ® Porcs, pollastres, dindis Dinamarca B. licheniformis i B. subtilis
Esporafeed Plus ® Porcs Espanya B. cereus
Lactopure ® Pollastres, vedells, porcs Índia B. coagulans *
Neoferm BS 10 ® Pollastres, vedells, porcs França B. clausii
Toyocerin ® Vedells, pollastres, conills i porcs Japó B. cereus

 

Les espècies de Bacillus que veiem en aquestes Taules són les que realment s’hi troben, un cop feta la identificació, ja que molts d’aquests productes estan mal etiquetats com a Bacillus subtilis o fins i tot com a Lactobacillus (Green et al. 1999; Hoa et al 2000). Aquests errors en l’etiquetatge poden ser preocupants per al consumidor, i sobretot per qüestions de seguretat, ja que alguns dels trobats són Bacillus cereus, que s’ha vist que pot ser causa d’infeccions gastrointestinals ja que força soques produeixen enterotoxines (Granum & Lund 1997; Hong et al. 2005)

Els possibles Bacillus probiòtics han estat aïllats de diversos orígens. Per exemple recentment se n’han aïllat alguns B. subtilis de l’esmentat chongkukjang coreà, que tenen bones característiques de resistència a les condicions del tracte gastrointestinal (GI) i activitat antimicrobiana contra Listeria, Staphylococcus, Escherichia i fins i tot contra B. cereus (Lee et al 2017).

Un d’aquests productes farmacèutics més coneguts és l’Enterogermina (Figura 5), amb espores de B. subtilis, que és recomanat per al tractament de desordres intestinals associats a alteracions de la microbiota (Mazza 1994).

Figuresv1 copy.ppt

Figura 5. Enterogermina amb espores de Bacillus subtilis (Cutting 2011)

 

Bacillus al tracte gastrointestinal: hi són ? hi poden sobreviure ?

S’ha discutit si les espores administrades poden germinar al tracte GI. Treballant amb ratolins, Casula & Cutting (2002) han utilitzat B. subtilis modificats, amb un gen quimèric ftsH-lacZ, que s’expressa només en cèl·lules vegetatives, amb el que es poden detectar per RT-PCR fins a només 100 bacteris. D’aquesta manera han vist que les espores germinen en nombres significatius al jejú i a l’ili. O sigui, que les espores podrien colonitzar l’intestí prim, encara que transitòriament.

De manera similar, Duc et al. (2004) han conclòs que les espores de B. subtilis poden germinar al budell perquè després del tractament oral dels ratolins, se n’excreten més espores a la femta que les ingerides, senyal que han pogut proliferar. També han detectat, mitjançant RT-PCR, mRNA dels bacils vegetatius després de l’administració de les espores, i a més a més, s’ha observat que el ratolí genera resposta amb IgG contra cèl·lules vegetatives del bacteri. O sigui, que les espores no serien passavolants transitoris, sinó que germinarien passant a cèl·lules vegetatives, les quals tindrien una interacció activa amb les cèl·lules hoste o la microbiota, augmentant-ne l’efecte probiòtic.

Amb tot això, potser caldria considerar a molts Bacillus no com a al·lòctons al tracte GI, sinó com a bacteris amb un cicle de vida bimodal de creixement i esporulació, tant al medi ambient com dins el tracte GI de molts animals (Hong et al. 2005).

En quant a la presència normal de Bacillus a l’intestí, quan s’estudien els diferents microorganismes habitants del digestiu humà per anàlisi metagenòmic del DNA de la microbiota, el gènere Bacillus no apareix (Xiao et al. 2015). Com veiem (Figura 6), els més habituals són Bacteroides i Clostridium, seguits de diversos enterobacteris i altres, inclosos els bifidobacteris.

Fig 6 Xiao nbt.3353-F2

Figura 6. Els 20 gèneres bacterians més abundants a l’intestí d’humans (dreta) i ratolins (esquerra) (Xiao et al. 2015).

 

Malgrat això, s’han aïllat diverses espècies de Bacillus al tracte GI de pollastres, tractant mostres fecals amb calor i etanol per seleccionar només les espores, seguit d’incubació aeròbica (Barbosa et al. 2005). I més en concret, la presència de B. subtilis a la microbiota d’humans s’ha confirmat mitjançant aïllament selectiu en biòpsies d’ili i també de mostres fecals (Hong et al. 2009). Aquestes soques de B. subtilis presentaven gran diversitat i tenien capacitat de formar biofilms, esporular anaeròbiament i secretar antimicrobians, amb la qual cosa es confirma l’adaptació d’aquests bacteris a l’intestí, i per tant poden ser considerats comensals intestinals, i no solament bacteris del sòl.

 

Seguretat dels Bacillus probiòtics

El consum oral de quantitats importants de microorganismes viables que no són molt usuals al tracte GI posa sobre la taula dubtes addicionals sobre la seguretat. Això encara més en l’ús d’espècies que no tenen una història d’utilització segura en aliments, com és el cas dels bacteris esporulats. Fins i tot els habitants normals de l’intestí poden actuar a vegades com a patògens oportunistes (Sanders et al. 2003).

Amb l’excepció de B. anthracis i B. cereus, les diverses espècies de Bacillus generalment no es consideren patogèniques. Per suposat, les espores de Bacillus són consumides de forma usual sense adonar-se’n amb els aliments i en alguns fermentats. Encara que els Bacillus són reconeguts com a GRAS per a la producció d’enzims, fins ara la FDA no ha garantit l’estatus de GRAS per a cap esporulat amb aplicació com a probiòtic, ni Bacillus ni Clostridium. Mentre que Lactobacillus i Bifidobacterium han estat subjecte de nombroses i rigoroses proves de no toxicitat crònica i aguda, i un munt d’experts han revisat dades i han conclòs que són segurs com a probiòtics, no hi han dades de toxicitat publicades sobre Bacillus en relació al seu ús com a probiòtics. En fer un repàs al Medline d’articles on surti el terme “probiotic” limitant-se a estudis clínics, de 123 referències no hi ha cap on surti Bacillus (Sanders et al. 2003).

En canvi, hi ha alguns estudis clínics on soques de Bacillus han estat detectades com a toxigèniques. Tot això explica que alguns productors de Bacillus probiòtics es refereixen a ells amb l’enganyós nom de Lactobacillus sporogenes, espècie inexistent, com es pot comprovar al NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/?term=lactobacillus+sporogenes).

Finalment, cal recordar l’informe conjunt sobre probiòtics de la FAO (Organització de les Nacions Unides per a l’Alimentació i l’Agricultura) i la OMS (Organització Mundial de la Salut) (FAO/WHO 2006), que suggereix un conjunt de directrius per tal que un producte sigui utilitzat com a probiòtic, tant en forma única com en forma de nou suplement alimentari. Aquestes recomanacions són:

  1. Que el microorganisme estigui ben caracteritzat a nivell d’espècie, utilitzant mètodes fenotípics i genotípics (ex. 16S rRNA).
  2. Que la soca en qüestió estigui dipositada en alguna col·lecció de cultius reconeguda internacionalment.
  3. Avaluació de la soca in vitro per determinar-ne l’absència de factors de virulència: que no sigui citotòxica ni envaeixi cèl·lules epitelials, i que no produeixi enterotoxines o hemolisines o lecitinases.
  4. Determinació de la seva activitat antimicrobiana, i el perfil de resistència, incloent l’absència de gens de resistència i la incapacitat per transferir factors de resistència.
  5. Avaluació preclínica de la seva seguretat en models animals.
  6. Confirmació en animals demostrant-ne la seva eficàcia.
  7. Avaluació en humans (Fase I) de la seva seguretat.
  8. Avaluació en humans (Fase II) de la seva eficàcia (si fa l’efecte esperat) i eficiència (amb el mínim de recursos i el mínim temps).
  9. Etiquetatge correcte del producte, incloent gènere i espècie, dosi precisa i condicions de conservació.

FAO WHO

Conclusions

La utilització de Bacillus com a probiòtics, sobretot en forma de suplements dietètics, està augmentant molt ràpidament. Cada cop més estudis científics demostren els seus beneficis, com estimulació immune, activitats antimicrobianes i competència exclusiva. El seu principal avantatge és que poden ser produïts fàcilment i que el producte final, les espores, és molt estable, amb la qual cosa poden ser incorporats fàcilment al menjar quotidià. A més, hi ha estudis que suggereixen que aquests bacteris poden multiplicar-se al tracte GI i poden ser considerats com a residents temporals (Cutting 2011).

D’altra banda, cal demanar un major rigor en la selecció i control dels Bacillus utilitzats, ja que alguns, si no han estat ben identificats, podrien ser causa de trastorns intestinals. En qualsevol cas, donat que el nombre de productes venuts com a probiòtics que contenen els esporulats Bacillus està augmentant molt, cal no donar per suposat que tots són segurs i cal avaluar cas per cas (Hong et al 2005).

 

Bibliografia

Barbosa TM, Serra CR, La Ragione RM, Woodward MJ, Henriques AO (2005) Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 71, 968-978.

Casula G, Cutting SM (2002) Bacillus probiotics: Spore germination in the gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 68, 2344-2352.

Chukeatirote E (2015) Thua nao: Thai fermented soybean. J Ethnic Foods 2, 115-118.

Cutting SM (2011) Bacillus probiotics. Food Microbiol 28, 214-220.

Duc LH, Hong HA, Barbosa TM, Henriques AO, Cutting SM (2004) Characterization of Bacillus probiotics available for human use. Appl Environ Microbiol 70, 2161-2171.

FAO/WHO (2006) Probiotics in food. Health and nutritional properties and guidelines for evaluation. Fao Food and Nutrition Paper 85. Reports of Joint FAO/WHO expert consultations.

Fontana L, Bermudez-Brito M, Plaza-Diaz J, Muñoz-Quezada S, Gil A (2013) Sources, isolation, characterization and evaluation of probiotics. Brit J Nutrition 109, S35-S50.

Granum, P. E., T. Lund (1997) Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Lett. 157:223–228.

Green, D. H., P. R. Wakeley, A. Page, A. Barnes, L. Baccigalupi, E. Ricca, S. M. Cutting (1999) Characterization of two Bacillus probiotics. Appl Environ Microbiol 65, 4288–4291.

Hoa, N. T., L. Baccigalupi, A. Huxham, A. Smertenko, P. H. Van, S. Ammendola, E. Ricca, A. S. Cutting (2000) Characterization of Bacillus species used for oral bacteriotherapy and bacterioprophylaxis of gastrointestinal disorders. Appl Environ Microbiol 66, 5241–5247.

Hong HA, Dic LH, Cutting SM (2005) The use of bacterial spore formers as probiotics. FEMS Microbiol Rev 29, 813-835.

Hong HA, Khaneja R, Tam NMK, Cazzato A, Tan S, Urdaci M, Brisson A, Gasbarrini A, Barnes I, Cutting SM (2009) Bacillus subtilis isolated from the human gastrointestinal tract. Res Microbiol 160, 134-143.

Lee S, Lee J, Jin YI, Jeong JC, Hyuk YH, Lee Y, Jeong Y, Kim M (2017) Probiotic characteristics of Bacillus strains isolated from Korean traditional soy sauce. LWT – Food Sci Technol 79, 518-524.

Mazza P (1994) The use of Bacillus subtilis as an antidiarrhoeal microorganism. Boll Chim. Farm. 133, 3-18.

Nimrat S, Suksawat S, Boonthai T, Vuthiphandchai V (2012) Potential Bacillus probiotics enhance bacterial numbers, water quality and growth during early development of white shrimp (Litopenaeus vannamei). Veterinary Microbiol 159, 443-450.

Phromraksa P, Nagano H, Kanamaru Y, Izumi H, Yamada C, Khamboonruang C (2009) Characterization of Bacillus subtilis isolated from asoian fermented foods. Food Sci Technol Res 15, 659-666.

Sanders ME, Morelli L, Tompkins TA (2003) Sporeformers as human probiotics: Bacillus, Sporolactobacillus, and Brevibacillus. Compr Rev Food Sci Food Safety 2, 101-110

Vaseeharan, B., P. Ramasamy (2003) Control of pathogenic Vibrio spp. by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus monodon. Lett Appl Microbiol 36, 83–87

World Gastroenterology Organisation Global Guidelines (2011) Probiotics and Prebiotics.

Xiao et al. (2015) A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnol 33, 1103-1108.

Fig 0 pinterest-com cool bacillus-subtilis-science-comics

Un nou probiòtic activa la microbiota contra el càncer de fetge

Click here for the english version:  A new probiotic modulates gut microbiota against hepatocellular carcinoma

13 juliol 2016

Els darrers anys s’han anat desvetllant els efectes beneficiosos de la microbiota intestinal humana sobre diversos marcadors de la salut, com la inflamació, la resposta immune, les funcions metabòliques i el pes, així com la importància que tenen aquests bacteris simbiòtics nostres. En relació a la nostra microbiota vegeu per exemple aquests altres posts del meu blog: “Els clostridis bons ens eviten al·lèrgies“, “Bacteris controlant el que mengem” o “Bacteris de la llet materna“.

Al mateix temps s’ha vist que els probiòtics poden ser una bona solució per a moltes malalties amb la microbiota intestinal afectada. Efectivament, s’ha demostrat el paper beneficiós dels probiòtics per tal de reduir la inflamació gastrointestinal i prevenir el càncer colorectal.

Ara bé, recentment s’ha observat que els probiòtics poden tenir efectes beneficiosos en altres parts del cos més enllà del tracte gastrointestinal, en concret amb efectes immunomoduladors sobre un carcinoma hepatocel·lular (CHC). En efecte, investigadors de la Universitat de Hong Kong, juntament amb altres de la Universitat de Finlàndia Oriental, han publicat un estudi (Li et al, PNAS, 2016) en aquest sentit, en el qual han vist reduccions del 40% del pes i mida del tumor CHC del fetge de ratolins als que se’ls havia administrat un nou producte barreja de probiòtics, “Prohep”.

El carcinoma hepatocel·lular (CHC) és el tipus més usual de càncer de fetge, és el 2n càncer més mortal, i força abundant en llocs amb taxes altes d’hepatitis. A més, el fàrmac més utilitzat per reduir la proliferació del tumor, el sorafenib, és caríssim. El cost d’aquest inhibidor multiquinasa és de 3400€, per a les 112 pastilles de 200 mg del tractament recomanat de 4 pastilles al dia durant un mes. En canvi, qualsevol tractament amb probiòtics que s’arribés a demostrar que fos eficaç i pogués substituir aquest fàrmac, seria molt més econòmic.

La nova barreja de probiòtics Prohep està compost per diversos bacteris: Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), i el conjunt inactivat pel calor VSL#3 (1:1:1), que conté Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium breve, Bf. longum, Bf. infantis, Lb. acidophilus, Lb. plantarum, Lb. paracasei, i Lb. delbrueckii.

En el treball esmentat, Li et al. (2016) van alimentar ratolins amb el Prohep durant una setmana abans d’inocular-los un tumor al fetge, i van observar una reducció del 40% del pes i mida del tumor en comparació als animals control. Com veiem a la Figura 1, l’efecte és significatiu als 35 dies, i també per als que se’ls administra el Prohep el mateix dia de la inoculació del tumor. Lògicament, l’efecte de reducció és molt més manifest en administrar un compost antitumoral com Cisplatina.

Aquests investigadors van veure que la reducció del tumor era degut a la inhibició de l’angiogènesi, el procés que fa generar nous vasos sanguinis a partir dels existents, cosa essencial per al creixement tumoral. Relacionat amb la reducció tumoral, van trobar nivells alts del GLUT-1+ hipòxic, o sigui, que al tumor hi havia hipòxia causada pel menor flux sanguini, ja que aquest era un 54% menor, respecte als controls.

 

Fig 1 Li-Fig1B tumor size - days tumor

Figura 1. Variació de mida del tumor. ProPre: administració de Prohep 1 setmana abans d’inoculació del tumor; ProTreat: administració de Prohep el mateix dia d’inoculació del tumor; Cisplatin: administració d’aquest antitumoral. (Fig 1 B de Li et al, 2016).

 

També van determinar que hi havia una menor quantitat del factor angiogènic proinflamatori IL-17 i de les cèl·lules Th17 del sistema immune, que s’associen també al càncer. La menor inflamació i angiogènesi limiten el creixement del tumor.

I a més a més, aquests investigadors van establir que aquests efectes beneficiosos de l’administració dels probiòtics estava relacionats amb l’abundància de bacteris beneficiosos de la microbiota intestinal pròpia dels ratolins, que analitzaren per metagenòmica. O sigui, que els probiòtics modulen la microbiota, afavorint alguns bacteris propis, que són els que produeixen metabòlits antiinflamatoris com la citoquina IL-10 i que suprimeixen la diferenciació de les cèl·lules Th17.

 

Fig 2 gut microbiota Eye of Science

Figura 2. Bacteris de la microbiota intestinal humana al microscopi electrònic de rastreig (SEM) (Imatge colorejada, de Eye of Science / Science Source)

 

Alguns d’aquests bacteris de la microbiota identificats per metagenòmica als ratolins que se’ls havia administrat el Prohep són Prevotella i Oscillibacter. El primer és un bacteri gram-negatiu bacteroidal, que és abundant a la microbiota de nen africans rurals amb dietes riques en carbohidrats. Oscillibacter és un gram-positiu clostridial, que es coneix als humans com a productor del neurotransmissor GABA. Són un exemple més de la importància d’alguns bacteroidals i clostridials en la microbiota intestinal, ja que en són majoria, i malgrat que no són ni molt menys utilitzats com a probiòtics, cada cop se’ls troba més funcions positives, com per exemple evitant al·lèrgies (Els clostridis bons ens eviten al·lèrgies).

Se sap que aquests bacteris produeixen metabòlits antiinflamatoris i per tant serien els principals implicats en regular l’activitat de les cèl·lules immunes que propicien el creixement del tumor. La reducció del tumor observada en aquests experiments amb ratolins seria efecte de l’acció combinada dels mateixos bacteris probiòtics administrats junt amb la microbiota pròpia afavorida per aquests. Veiem un possible esquema d’aquestes accions a la Figura 3.

 

Fig 3 Sung fig 2

Figura 3. Diagrama simplificat dels possibles mecanismes dels bacteris intestinals influint sobre la polarització de les cèl·lules Th17 de la làmina pròpia de la mucosa intestinal. Els bacteris de la microbiota activarien les cèl·lules dendrítiques, les quals segreguen citoquines (IL-22, IL-23, IL-27). Els bacteris poden promoure la immunitat de Th17 induint IL-23, que pot estar involucrada mitjançant la senyal de lligands TLR, o ATP extracel·lular o l’amiloide A sèric (SAA). Mentrestant, algunes soques probiòtiques podrien inhibir el desenvolupament de Th17 per la via de la producció de IL-12 i IL-27, a banda d’afavorir el creixement i colonització dels bacteris propis que indueixen Th17 (Sung et al 2012, Fig. 2).

 

Encara que ja sabem que la progressió dels càncers és un procés molt complex, i que als microambients del tumor hi ha una infiltració de molts diversos tipus de cèl·lules del sistema immunitari com cèl·lules T, neutròfils, cèl·lules killer, macròfags, etc, la subpoblació de cèl·lules helper Th17 sembla que és prevalent en la progressió dels tumors, i per tant, aquests efectes dels probiòtics i la microbiota obren bones perspectives.

Encara és aviat per dir si aquests descobriments contribuiran a un tractament del càncer de fetge humà, i per tant calen investigacions en humans per veure si aquests probiòtics podrien ser utilitzats com a tal o en tàndem amb algun fàrmac, en funció del estadi i mida del tumor. En qualsevol cas, s’obre un nou ventall de possibilitats de recerca dels mecanismes moleculars dels efectes beneficiosos dels probiòtics més enllà del tracte intestinal.

 

Bibliografia

El-Nezami H (2016 april 27) HKU develops novel probiotic mixture “Prohep” that may offer potential therapeutic effects on liver cancer. The University of Hong Kong (HKU) 27 Apr 2016

El-Nezamy H, Lee PY, Huang J, Sung YJ (2015) Method and compositions for treating cancer using probiotics. Patent WO 2015021936 A1

Li J, Sung CYJ, Lee N, Ni Y, Pihlajamäki J, Panagiotou G, El-Nezami H (2016) Probiotics modulated gut microbiota suppresses hepatocellular carcinoma growth in mice. PNAS E1306-E1315

Oelschlaeger TA (2010) Mechanisms of probiotic actions – A review. Int J Med Microbiol 300, 57-62

Packham C (2016) Probiotics dramatically modulate liver cancer growth in mice. Medical Press, Med Research 23 Feb 2016

Silgailis M (2016) Treating some cancers with probiotics in the future ? Probiotic Prohep. Lacto Bacto: Health, Microbes and More 23 Feb 2016

Sung CYJ, Lee NP, El-Nezami H (2012) Regulation of T helper by bacteria: an approach for the treatment of hepatocellular carcinoma. Int J Hepatology ID439024, doi:10.1155/2012/439024

UEF News and Events (2016) A novel probiotic mixture may offer potential therapeutic effects on hepatocellular carcinoma. University of Eastern Finland 1 Mar 2016

 

Microbiota de la pell humana, en part compartida amb el gos de casa

Click here for the english version: Human skin microbiota partly shared with the dog

17 novembre 2015

Diversitat de la microbiota humana a les diferents parts del cos i entre individus

Com havia comentat en altres posts anteriors d’aquest blog (Clostridis bons del budell 1 març 2015; Bacteris controlant el que mengem 8 set 2014; Bacteris de la llet materna 26 gener 2013), cada cop es fa més patent la importància que té la microbiota del nostre cos, o sigui el conjunt de microorganismes, sobretot bacteris, amb els quals convivim.

La microbiota humana varia d’un individu a un altre, en relació a la dieta, l’edat i les característiques fenotípiques i genètiques de cadascú. I a més, com que no vivim aïllats, també hi influeix l’entorn, o sigui les altres persones amb les que interactuem, i és clar, els altres animals amb que convivim, com els gossos i altres animals domèstics. Tots plegats també tenen microbiota pròpia.

El cos humà és la llar de molts microorganismes diferents, amb bacteris (i arquees), fongs i virus que viuen a la pell, a l’intestí i en diversos altres llocs en el cos (Figura 1). Si bé molts d’aquests microbis són beneficiosos als seus hostes humans, sabem poc sobre la majoria d’ells. Les primeres investigacions es van centrar en la comparació dels microorganismes que es troben en individus sans amb els que es troben en les persones que pateixen d’una malaltia en particular. Més recentment els investigadors s’han interessat en les qüestions més generals, com entendre com s’estableix aquesta microbiota i conèixer les causes de les similituds i diferències entre la microbiota de diferents individus.

 

Fig 1 Marsland

Figura 1. Proporcions de tipus de microorganismes que habiten a les diferents parts del cos humà: bacteris (cercles grans), fongs (cercles petits dreta) i virus (cercles petits esquerra) (Marsland & Gollwitzer 2014)

 

Ara ja se sap que les comunitats de microorganismes que es troben en els intestins de les persones relacionades genèticament tendeixen a ser més similars que els de les persones que no estan relacionades. D’altra banda, les comunitats microbianes que es troben en els intestins dels adults no relacionats que viuen a la mateixa llar són més similars que les dels adults no relacionats que viuen en diferents llars (Yatsunenko et al 2012). No obstant això, tots aquests estudis s’han centrat en l’intestí, i poc se sap sobre l’efecte de la relació, la convivència i l’edat en la microbiota en altres parts del cos, com és el cas de la pell.

 

Microbiota de la pell humana

La pell és un ecosistema d’uns 1,8 m2 de diversos hàbitats, amb plecs, invaginacions i nínxols especialitzats que acullen molts tipus de microorganismes. La funció principal de la pell és com a barrera física, protegint el cos d’assalts potencials per part d’organismes estranys o substàncies tòxiques. Com que també és la interfase amb l’ambient extern, està colonitzat per diversos microorganismes, incloent bacteris, fongs, virus, així com àcars (Figura 2). A la superfície destaquen proteobacteris, propionibacteris i estafilococs i alguns fongs com Malassezia (un basidiomicet amb un estadi unicel·lular i un altre micelià). Els àcars (en anglès mites) com Demodex folliculorum viuen al voltant dels fol·licles pilosos. Molts d’aquests microorganismes són innocus i a vegades aporten funcions vitals que el genoma humà no ha adquirit evolutivament. Els microorganismes simbiòtics protegeixen front a altres microbis patogènics o nocius. (Grice & Segre 2011).

Fig 2 Grice

Figura 2. Esquema de secció de pell humana amb els diversos microorganismes presents (Grice & Segre 2011).

 

En conseqüència amb la comentada diversitat de la microbiota, aquesta també és molt variada segons la regió de la pell que considerem (Figura 3), i per tant segons els diversos microambients, que com veiem poden ser de 3 característiques diferents: sebacis o oliosos, humits i secs.

Fig 3 Grice

Figura 3. Distribució topogràfica dels tipus de bacteris en diferents llocs de la pell (Grice & Segre 2011)

 

La pell és un complex entramat estructural, hormonal, nerviós, immunològic i microbià i en aquest sentit s’ha comprovat que la microbiota resident col·labora amb el sistema immune, especialment en la reparació de les ferides (Figura 4). Com veiem, en concret l’àcid lipoteicoic (LTA), integrant de la paret cel·lular bacteriana, alliberat per Staphylococcus epidermidis, estimula els receptors tipus Toll (Toll-Like Receptor) TLR2, que indueixen la producció de pèptids antimicrobians, i també s’estimulen els queratinòcits de l’epidermis via els TLR3 per desencadenar l’inflamació, amb producció d’interleucina i atracció de leucòcits (Heath & Carbone 2013). Tot plegat per assegurar la protecció homeostàtica i la defensa enfront possibles patògens. Més informació també a la revisió de Belkaid & Segre (2014).

Fig 4 Heath Fig1 ni.2680-F1

Figura 4. Contribució de la microbiota resident a la immunitat i la reparació de ferides (Heath & Carbone 2013)

 

A casa compartim microbiota, i amb el gos

Com dèiem al principi, l’entorn influeix en la microbiota d’un individu, i per tant, individus que viuen junts tendeixen a compartir part de la microbiota. Efectivament, això fou recentment estudiat per Song et al (2013), amb 159 persones i 36 gossos de 60 famílies (unitats conjugals amb nens i/o gossos). Els van estudiar la microbiota intestinal, de la llengua i de la pell. Van extreure el DNA d’un total de 1076 mostres, amplificant-ne la regió V2 del gen 16S rRNA amb encebadors específics, i van procedir a una seqüenciació multiplex d’alt rendiment (High-Throughput Sequencing) amb un equip Illumina GA IIx. En van obtenir un total d’uns 58 milions de seqüències, amb una mitjana de 54.000 per mostra, que van ser analitzades contrastant amb les bases de dades per saber quins tipus bacterians i en quines proporcions.

Els resultats foren que les comunitats microbianes eren més similars entre sí en individus que viuen junts, i sobretot les de la pell, més que no les intestinals o de la llengua. Això era cert per a totes les comparacions, incloent parelles d’humans, i parelles gos-humà. Com veiem a la Figura 5, el nombre de tipus bacterians compartits és més gran entre diferents parts (front, palmells de les mans i polpes dels dits del gos) de la pell del l’humà i el seu propi gos (barres blaves), que no de l’humà amb gossos d’altres famílies (barres vermelles), o dels gossos amb persones que no en tenen (barres verdes). També veiem que el nombre de tipus bacterians compartits és molt menor en comparar mostres fecals o la llengua (Song et al 2013).

Fig 5 Song

Figura 5. Nombres de filotipus (tipus filogenètics) bacterians compartits entre adults i els seus gossos (blau), els adults amb gossos d’altres (vermell) i adults que no tenen gossos amb gossos. Es comparen (gos-humà) fronts, mans, polpes de les potes, i també mostres fecals (stool) i llengües. Significativitat de ser diferents: *p<0.05, **p<0.001 (Song et al 2013)

 

Això suggereix que els humans probablement adquireixen molts dels microorganismes en la pell per contacte directe amb el seu entorn, i que els éssers humans tendeixen a compartir més microbis amb els individus, incloent a les seves mascotes, amb els que estan en contacte freqüent. Song et al. (2013) també van descobrir que, a diferència del que passa a l’intestí, les comunitats microbianes en la pell i la llengua dels lactants i els nens eren relativament similars a les dels adults. En general, aquestes troballes suggereixen que les comunitats microbianes que es troben a l’intestí canvien amb l’edat d’una manera que difereix significativament dels que es troben a la pell i la llengua.

Encara que no és el motiu principal d’aquest post, breument es pot comentar que globalment la microbiota intestinal dels gossos no és molt diferent de la dels humans en nombres (1011 per gram) i diversitat, si bé amb més proporció de Gram-positius (aprox. 60% clostridials, 12% lactobacils, 3% bifidobacteris i 3% corinebacteris) i menys Gram-negatius (2% bacteroides, 2% proteobacteris) (García-Mazcorro & Minamoto 2013).

 

Menys asma als infants que conviuen amb gossos

I encara que no s’ha acabat de demostrat la relació amb el que hem comentat de la microbiota, darrerament s’han trobat evidències dels beneficis de tenir gos per a la salut física, i no només psíquica. Uns investigadors suecs (Fall et al 2015) han fet un estudi amb tots els nadons nascuts (1 milió) a Suècia de 2001 al 2010, comptant els que patien asma als 6 anys. Com que els suecs tenen registre de tots els gossos també des de 2001, aquests investigadors han pogut relacionar la presència de gos a casa durant el primer any del nadó amb l’aparició d’asma o no als infants, i han arribat a la conclusió que els nens tenen un risc menor d’asma (un 50% menys) si s’han criat en presència d’un gos.

Resultats semblants s’han obtingut per a nens criats en granges o en ambients rurals, i per tant amb contacte amb altres animals. Tot plegat estaria d’acord amb l’anomenada “hipòtesi de la higiene”, segons la qual la menor incidència d’infeccions als països occidentals, i sobretot als “urbanites”, seria la causa de l’augment de malalties autoimmunes i al·lèrgies (Okada et al 2010). En línia amb hipòtesi, es creu que el sistema immune humà es beneficia de la convivència amb gossos o altres animals degut al fet de compartir part de la microbiota. Tanmateix, en aquests nens suecs que convivien amb gossos i tenien menys risc d’asma es detectà un lleuger risc de malaltia pneumòccica, cosa que lliga amb la hipòtesi esmentada: més infeccions i menys al·lèrgies (Steward 2015), però amb l’avantatge de què les infeccions són més fàcils de tractar, o prevenir amb vacunes.

Fig 0 stray-dog-saves-baby

 

Bibliografia

Belkaid Y, Segre JA (2014) Dialogue between skin microbiota and immunity. Science 346, 954-959

Fall T, Lundholm C, Örtqvist AK, Fall K, Fang F, Hedhammar A et al (2015) Early exposure to dogs and farm animals and the risk of childhood asthma. JAMA Pediatrics 69, 11, e153219

García-Mazcorro JF, Minamoto Y (2013) Gastrointestinal microorganisms in cats and dogs: a brief review. Arch Med Vet 45, 111-124

Heath WR, Carbone FR (2013) The skin-resident and migratory immune system in steady state and memory: innate lymphocytes, dendritic cells and T cells. Nature Immunology 14, 978-985

Marsland BJ, Gollwitzer ES (2014) Host–microorganism interactions in lung diseases. Nature Reviews Immunology 14, 827-835

Okada H, Kuhn C, Feillet H, Bach JF (2010) The “hygiene hypothesis” for autoimmune and allergic diseases: an update. Clin Exp Immunol 160, 1-9

Song SJ, Lauber C, Costello EK, Lozupone, Humphrey G, Berg-Lyons D, et al (2013) Cohabiting family members share microbiota with one another and with their dogs. eLife 2, e00458, 1-22

Steward D (2015) Dogs, microbiomes, and asthma risk: do babies need a pet ? MD Magazine, Nov 03

Yatsunenko T, Rey FE, Manary MJ, Trehan I, Dominguez-Bello MG, Contreras M, et al. 2012. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature 486, 222–7

 

 

El panda gegant és herbívor però té una microbiota intestinal de carnívor

Click here for the english version: The giant panda is herbivore but has the gut microbiota of a carnivore

26 agost 2015

El panda gegant (Ailuropoda melanoleuca, literalment en grec “peu de gat negre i blanc”) és una de les espècies de mamífers més intrigants evolutivament. Malgrat la seva dieta exclusivament herbívora, filogenèticament és com un ós, ja que és de la família Úrsids, dins l’ordre Carnívors. La seva dieta és 99% de bambú i l’altre 1% és mel, ous, peix, taronges, plàtans, nyams i fulles d’arbusts.

Viu en algunes serralades de la Xina central, principalment a la província de Sichuan, i també a les províncies de Shaanxi i Gansu. Degut a la construcció de granges, desforestació i altres desenvolupaments, el panda ha estat foragitat de les terres baixes on havia viscut. És una espècie en perill d’extinció que necessita protecció. Hi han uns 300 en captivitat i uns 3000 en llibertat. Malgrat que els nombres estan augmentant, segueix en perill d’extinció, sobretot pel seu espai limitat (uns 20.000 km2) i l’hàbitat molt específic (boscos de bambú).

Fig0 panda bamboo

Així doncs, el panda gegant té una dieta quasi exclusiva de diferents espècies de bambú, sobretot de fulles i tiges, molt fibroses, i els brots tendres a la primavera i estiu. És per tant una dieta de poca qualitat digestiva, amb poca proteïna i molta fibra i contingut de lignina. Es passen unes 14 h al dia menjant, i poden arribar a ingerir uns 12 kg de bambú al dia.

La majoria d’herbívors tenen modificacions del tracte digestiu que ajuden a la retenció de l’aliment en procés de digestió, i contenen poblacions microbianes que els permeten utilitzar com a menja exclusiva els materials vegetals rics en polisacàrids complexos, com la cel·lulosa i hemicel·lulosa. Aquestes especialitzacions poden ser la compartimentació de l’estómac, típica dels remugants i altres no remugants (cangurs, hàmster, hipopòtams i alguns primats) o bé l’engrandiment de l’intestí gros, característic dels èquids, alguns rosegadors i els lagomorfs (conills i llebres).

En canvi, i malgrat el seu règim exclusivament herbívor, sorprenentment el panda gegant té un tracte gastrointestinal típic dels carnívors, anatòmicament similar als del gos, el gat o l’ós rentador, amb un estómac simple, té el cec degenerat i el còlon és molt curt. El tracte gastrointestinal dels pandes és unes 4 vegades la mida del cós, com altres carnívors, mentre que als herbívors és unes 10-20 vegades el cós, per tal de digerir eficientment grans quantitats de farratge. Amb això, el temps del trànsit intestinal del panda és molt curt, menys de 12 h. Tot això limita molt la capacitat de possibilitats fermentatives dels materials vegetals (Williams et al. 2013).

Per aquests motius, la digestió del bambú per al panda és molt ineficient, malgrat la seva dependència. Els pandes consumeixen l’equivalent al 6% del seu pes corporal per dia, amb una digestibilitat de la matèria seca del bambú del 20%. D’aquest, un 10% correspon a la poca proteïna que conté el bambú, i la resta és dels polisacàrids, en concret amb uns coeficients de digestió del 27% per a les hemicel·luloses i del 8% per a la cel·lulosa.

Sembla com si el panda gegant s’hagués especialitzat en el consum d’una planta amb alt contingut en fibra, sense haver modificat l’aparell digestiu, a base d’una masticació eficient, ingerint-ne grans quantitats, digerint els continguts cel·lulars enlloc de les parets cel·lulars vegetals, i excretant ràpidament els residus no digerits (Dierenfield et al. 1982).

A més a més, tenir una dependència d’un sol tipus de planta com és el bambú pot comportar mancances nutricionals segons els cicles estacionals de la planta. En aquest sentit, recentment (Nie et al. 2015) s’han estudiat les concentracions de calci, fòsfor i nitrogen de les diferents parts del bambú que mengen una població de pandes lliures. Han vist que els pandes dins del seu hàbitat fan una migració estacional en dues zones de diferent alçada al llarg de l’any i que s’alimenten de dues espècies diferents de bambú. Ambdues espècies tenen més calci a les fulles i més fòsfor i nitrogen a les tiges. Com que la variació estacional d’aparició i caiguda de fulles de les 2 espècies és diferent a causa de la diferent alçada, quan els pandes són en una de les zones mengen les fulles d’una de les espècies i les tiges de l’altre, mentre que ho fan al revés quan són a l’altra zona. O sigui, que els pandes sincronitzen les seves migracions estacionals per tal de treure’n el màxim rendiment nutricional d’ambdues especies de bambú.

Un altre inconvenient de la dependència del bambú és la seva floració. És un fenomen natural que passa cada 40-100 anys, i quan el bambú floreix, es mor, reduint la disponibilitat de menjar per als pandes. Pels anys 1970-1980 hi hagués dues floracions a gran escala a l’hàbitat dels pandes, i hi van haver més de 200 morts per aquesta raó. Tanmateix, i donat que segurament els pandes s’han trobat en la seva evolució amb moltes altres floracions massives, quan s’hi troben cerquen altres espècies de bambú o recorren llargues distàncies per cobrir les seves necessitats alimentàries (Wei et al. 2015).

En compensació, i com a adaptació a aquest menjar tant específic, el panda gegant té una sèrie de característiques morfològiques úniques, com unes fortes mandíbules i molars molt poderosos, i sobretot un pseudo-polze, com si tingués 6 dits, que és l’ós sesamoide radial engrandit, fent com un polze oposable, que li serveix per agafar millor les canyes de bambú (Figura 1).

Fig1 panda's thumb

Figura 1. El pseudo-polze del panda gegant. Imatge treta de Herron & Freeman (2014).


I cóm és que el panda va passar a ser herbívor ?

S’ha estimat que el precursor del panda gegant, omnívor com altres úrsids, va començar a menjar bambú com a mínim fa 7 milions d’anys (Ma), i va esdevenir completament dependent del bambú entre 2 i 2,4 Ma. Aquest canvi de dieta probablement va anar lligat a diverses mutacions al seu genoma, donant lloc a defectes del metabolisme de la dopamina en relació a l’apetència per la carn, i sobretot de la pseudogenització del gen Tas1r1 (Figura 2), del receptor del gust d’umami (Jin et al. 2011). L’umami és un dels 5 gustos bàsics, junt amb el dolç, salat, àcid i amarg, i ve a ser com el gust “saborós”, que normalment recorda la carn, i està relacionat amb el L-glutàmic, abundant a la carn. Aquesta mutació que feia prescindir al panda del gust umami afavorí la pèrdua d’apetit del panda per la carn i reforçà el seu estil de vida herbívor. Tanmateix, probablement altres factors addicionals devien estar implicats, ja que el gen Tas1r1 està intacte en herbívors com el cavall i la vaca (Zhao et al. 2010).

Fig2 Zhao F1 large

Figura 2. Arbre filogenètic d’alguns carnívors amb les dates per al panda gegant deduïdes dels fòssils (en blau) i de l’estudi molecular del gen TasTr1 fet per Zhao et al. (2010).


La microbiota intestinal del panda

Com era d’esperar, en fer la seqüenciació del genoma complet del panda gegant (Li et al. 2010) no s’han trobat gens específics responsables de la digestió de la cel·lulosa i hemicel·luloses. Lògicament, la possible digestió d’aquests polisacàrids complexos de les fibres del bambú aniria a càrrec dels microorganismes cel·lulolítics del tracte intestinal. Cal estudiar per tant si hi són al panda.

En estudiar les seqüències del 16S ribosomal de les microbiotes fecals dels diversos mamífers s’observa en general un augment de la diversitat bacteriana en sentit carnívors – omnívors – herbívors (Ley et al. 2008). Aquesta diversitat és menor en els pandes que als herbívors, i com veiem a la Figura 3, els pandes queden agrupats amb els carnívors (cercles vermells) malgrat ser herbívors del punt de vista de dieta.

Fig3 Ley

Figura 3. Anàlisi de components principals (PC) de les comunitats bacterianes fecals de mamífers amb diferents colors segons la dieta predominant (Ley et al. 2008)


La microbiota intestinal de la majoria dels herbívors conté sobretot bacteris anaerobis dels grups de Bacteroides, Clostridials, Fibrobacterals i Espiroquetals, que tenen les capacitats enzimàtiques per degradar els materials fibrosos vegetals i així proveeixen de nutrients als seus hostes. Al contrari, els omnívors i sobretot els carnívors tenen una microbiota predominant d’anaerobis facultatius, com les Enterobacteriaceae, a banda d’alguns Firmicutes, que inclouen Clostridials i alguns Lactobacil als, i Bacteroides.

En quant al panda gegant, els primers estudis fets amb mètodes tradicionals dependents de cultiu i anàlisi dels gens 16S rRNA amplificats (Wii et al. 2007) van identificar les Enterobacteriaceae i Streptococcus com a predominants en la microbiota intestinal. Per tant, aquest estudi suggeria que la microbiota del panda és molt semblant a la dels carnívors, com veiem en l’estudi comentat comparatiu de diversos mamífers (Ley et al. 2008), i per tant amb molt poca capacitat d’utilitzar cel·lulosa o hemicel·lulosa.

Tanmateix, un estudi posterior fet amb tècniques de seqüenciació del 16S (Zhu et al. 2011) a partir de mostres fecals de 15 pandes gegants va arribar a unes conclusions ben diferents i semblava que van trobar per primer cop proves de la digestió de cel·lulosa per la microbiota del panda gegant. En analitzar 5500 seqüències, van trobar 85 tàxons diferents, dels quals el 83% eren Firmicutes (Figura 4), i entre aquests n’hi havia 13 tàxons de Clostridium (7 d’ells exclusius dels pandes), i alguns d’aquests amb capacitat de digestió de cel·lulosa. A més, amb anàlisi metagenòmica d’alguns dels pandes van trobar alguns gens putatius per a enzims per digerir cel·lulosa, beta-glucosidasa i xilan-1,4-beta-xilosidasa per a aquests Clostridium. Tot plegat, van concloure que la microbiota del panda gegant tenia una moderada capacitat de degradació dels materials cel·lulòsics.

Fig4 Zhu 2011-Fig1C

Figura 4. Percentatges de seqüències dels principals grups bacterians trobats a les mostres fecals d’individus de panda gegant salvatges (W1-W7) i en captivitat (C1-C8) segons Zhu et al. (2011). Sota cada individu s’indica el n. de seqüències analitzades.


Però, tot just fa dos mesos s’ha publicat un treball (Xue et al. 2015) que sembla tornar enrere, concloent que la microbiota intestinal del panda gegant és molt semblant a la dels carnívors i poca cosa té d’herbívora. És un treball exhaustiu de seqüenciació massiva d’última generació del 16S rDNA amb mostres fecals de 121 pandes de diferents edats al llarg de tres estacions de l’any. Han obtingut unes 93000 seqüències, corresponents a 781 tàxons diferents.

Han trobat una predominança de Enterobacteriaceae i de Streptococcus (vermell fosc i blau fosc respectivament, Figura 5 A), i molts pocs representants dels probables cel·lulolítics com els Clostridials. A més, aquests no es veuen augmentats quan hi ha més fulles i tiges de bambú disponibles (fase T3). Aquests resultats es corresponen amb el que ja se sabia del baix nombre de gens de cel·lulases i hemicel·lulases, un 2%, fins i tot menor que al microbioma dels humans. Aquesta negligible contribució de la microbiota a la digestió de la cel·lulosa, junt amb el fet comentat que el panda és força ineficient digerint el bambú, contradiu la hipotètica importància de la digestió per part de la microbiota que s’havia suggerit pocs anys abans, com hem vist abans.

A més, en aquest treball s’ha vist molta varietat de composició de microbiota entre individus (Figura 5 B).

Fig5 Xue F1 large

Figura 5. Composició de la microbiota intestinal de 121 pandes gegants, amb (A) els gèneres dominants a totes les mostres i (B) la contribució relativa dels gèneres dominants a cada individu, agrupats per edat i temps de mostreig (Xue et al. 2015).


En aquest treball, quan han fet l’anàlisi comparativa entre la composició de la microbiota intestinal del panda gegant amb la d’altres mamífers de les diferents dietes, han confirmat que el panda s’agrupa altre cop amb els carnívors i queda ben lluny dels herbívors (Figura 6).

Fig6 Xue Fig4

Figura 6. Anàlisi de components principals de les comunitats de les microbiotes de mostres fecals de 121 pandes gegants (formes en blanc), en comparació amb les d’altres herbívors (verd), omnívors (blau) i carnívors (vermell). Les diferents formes corresponen a diferents treballs: els cercles són de Xue et al. (2015), el treball d’on s’ha tret la Figura.


Tot plegat, les característiques peculiars de la microbiota del panda gegant contribueixen al perill d’extinció que pateix. Al contrari que la majoria d’altres espècies de mamífers que han evolucionat les seves microbiotes i anatomies digestives optimitzant-les per a les seves dietes específiques, l’aberrant coevolució del panda, la seva microbiota i la seva dieta particular, és ben bé enigmàtica. Per aclarir-ho i saber com preservar aquest animal amenaçat, caldrà seguir estudiant-ho combinant metagenòmica, metatranscriptòmica, metaproteòmica i meta-metabolòmica per conèixer bé la estructura i el metabolisme de la microbiota intestinal i la seva relació amb les funcions digestives i l’estatus nutritiu del panda gegant (Xue et al. 2015).

Referències

Dierenfield ES, Hintz HF, Robertson JB, Van Soest PJ, Oftedal OT (1982) Utilization of bamboo by the giant panda. J Nutr 112, 636-641

Herron JC, Freeman S (2014) Evolutionary Analysis, 5th ed. Benjamin Cummings

Jin K, Xue C, Wu X, Qian J, Zhu Y et al. (2011) Why Does the Giant Panda Eat Bamboo? A Comparative Analysis of Appetite-Reward-Related Genes among Mammals. PLos One 6, e22602

Ley RE, Hamady M, Lozupone C, Turnbaugh PJ, Ramey RR et al. (2008) Evolution of Mammals and Their Gut Microbes. Science 320, 1647-1651

Li R, Fan W, Tian G, Zhu H, He L et 117 al. (2010) The sequence and de novo assembly of the giant panda genome. Nature 463, 311–317

Nie Y, Zhang Z, Raubenheimer D, Elser JJ, Wei W, Wei F (2015) Obligate herbivory in an ancestrally carnivorous lineage: the giant panda and bamboo from the perspective of nutritional geometry. Functional Ecology 29, 26–34

Rosen M (2015) Pandas’ gut bacteria resemble carnivores. Science News 19/05/2015

Wei G, Lu H, Zhou Z, Xie H, Wang A, Nelson K, Zhao L (2007) The microbial community in the feces of the giant panda (Ailuropoda melanoleuca) as determined by PCR-TGGE profiling and clone library analysis. Microb Ecol 54, 194–202

Wei F, Hu Y, Yan L, Nie Y, Wu Q, Zhang Z (2014) Giant Pandas Are Not an Evolutionary cul-de-sac: Evidence from Multidisciplinary Research. Mol Biol Evol 32, 4-12

Williams CL, Willard S, Kouba A, Sparks D, Holmes W et al. (2013) Dietary shifts affect the gastrointestinal microflora of the giant panda (Ailuropoda melanoleuca). J Anim Physiol Anim Nutr 97, 577-585

Xue Z, Zhang W, Wang L, Hou R, Zhang M et al. (2015) The bamboo-eating giant panda harbors a carnivore-like gut microbiota, with excessive seasonal variations. mBio 6(3), e00022-15

Zhao H, Yang JR, Xu H, Zhang J (2010) Pseudogenization of the Umami Taste Receptor Gene Tas1r1 in the Giant Panda Coincided with its Dietary Switch to Bamboo. Mol Biol Evol 27(12), 2669–2673

Zhu LF, Wu Q, Dai JY, Zhang SN, Wei FW (2011) Evidence of cellulose metabolism by the giant panda gut microbiome. Proc Natl Acad Sci USA 108, 17714–17719.

Els bacteris de la vinya i del “terroir”, i presència d’Oenococcus als raïms del Priorat

Click here for the english version: Bacteria of vineyard and terroir, and presence of Oenococcus in Priorat (South Catalonia) grapes

22 abril 2015 

Els viticultors creuen que la terra en la qual creixen les vinyes dóna una qualitat única als seus vins, i d’això en diuen el terroir, o terrer si ho traduïm al català. Es pot considerar que la resposta fisiològica de les vinyes al tipus de sòl i les condicions climàtiques, juntament amb les característiques de la varietat i la forma de cultiu, donen lloc a unes propietats organolèptiques del vi que defineixen el seu terroir (Zarraonaindia et al 2015). Ara bé, no es coneix gaire si hi podria haver una microbiota específica de cada terroir, ja que aquest tema s’ha estudiat relativament poc.

Els microorganismes vínics als raïms ? Saccharomyces no hi és o no se’l troba

Els principals protagonistes de les fermentacions víniques, la alcohòlica (Saccharomyces cerevisiae) i la malolàctica (Oenococcus oeni) normalment no apareixen fins que el most està fermentant, ja doncs al celler. En condicions normals de raïms sans, pràcticament no es troba S. cerevisiae.

Oenococcus oeni als raïms ? Em sembla que nosaltres l’hem trobat !

En quant a O. oeni, fins ara s’ha publicat molt poc sobre la seva presència i aïllament en els raïms. En diversos treballs, com Sieiro et al (1990), o més recentment Bae et al (2006), ja havien aïllat alguns bacteris làctics de la superfície de raïms, però no O. oeni. Només Garijo et al (2011) van aconseguir aïllar una colònia (una només) d’O. oeni a partir de raïms de la Rioja. D’altra banda, s’ha detectat el DNA d’O. oeni en alguna mostra de raïms de Bordeus (Renouf et al 2005, Renouf et al 2007) per PCR-DGGE del gen rpoB, encara que no van aïllar cap bacteri d’aquesta espècie.

Em plau poder comentar que recentment al nostre grup hem aconseguit aïllar O. oeni dels raïms i tipificar-ne diverses soques, i justament estem elaborant una publicació al respecte (Franquès et al 2015). Efectivament, l’equip de recerca de bacteris làctics BL-URV, junt amb els companys de llevats del mateix grup de Biotecnologia Enològica (Facultat d’Enologia de la Universitat Rovira i Virgili a Tarragona) estem treballant en un projecte europeu, el “Wildwine” (FP7-SME-2012 -315065), que té per objectius analitzar els microorganismes autòctons (d’aquí lo de “wild”) del sistema vitivinícola del Priorat, i seleccionar-ne soques amb potencial enològic. Al projecte també hi participen la DOQ Priorat i el celler Ferrer-Bobet, així com grups de recerca i associacions de cellers de Bordeus, el Piemont i Grècia. En el marc d’aquest projecte vam prendre mostres de raïms (garnatxa i carinyena) de diverses finques del Priorat (Figura 1), així com també de vins realitzant la fermentació malolàctica, i en vam obtenir uns 1900 aïllats de bacteris làctics. Vam optimitzar l’aïllament a partir dels raïms a partir de la polpa i del most amb diversos mètodes d’enriquiment, i així vam obtenir uns 110 aïllats de raïms, identificats com O. oeni per tècniques moleculars específiques. Un cop tipificats, hem comprovat que els seus perfils moleculars no coincideixen amb soques comercials i per tant són autòctones. A més, alguns d’aquests aïllats dels raïms també els hem trobat als vins fets als cellers corresponents.

Fig 1 garna-cari Priorat

Figura 1. Prenent mostres de garnatxa (esquerra) i carinyena (dreta) de finques del Priorat per tal d’aïllar bacteris làctics com Oenococcus (Fotos Albert Bordons).


La microbiota dels raïms

Els raïms tenen una ecologia microbiana complexa que inclou llevats, fongs micelials i bacteris. Alguns només es troben als raïms, com els fongs paràsits i els bacteris ambientals, i altres tenen la capacitat de sobreviure i créixer als vins: sobretot llevats, bacteris làctics i bacteris acètics. La proporció de tots plegats depèn de l’estat de maduració del raïm i de la disponibilitat de nutrients.

Quan els fruits són intactes, la microbiota predominant són els llevats basidiomicets com Cryptococcus i Rhodotorula, però quan són més madurs, comencen a tenir microfisures que faciliten la disponibilitat de nutrients i expliquen la predominança just abans de la verema d’ascomicets lleugerament fermentatius com Candida, Hanseniaspora, Metschnikowia i Pichia. Quan la pell ja està més danyada poden aparèixer llevats perjudicials com Zygosaccharomyces i Torulaspora, i bacteris acètics. Entre els fongs filamentosos poden haver-hi ocasionalment alguns molt perjudicials com Botrytis (la podridura) o Aspergillus productors d’ocratoxina, que encara que només són actius a la vinya, els seus productes poden afectar la qualitat del vi.

D’altra banda, a la superfície dels raïms s’han aïllat bacteris ubics ambientalment com diversos enterobacteris, Bacillus, i estafilococs, però cap d’ells pot créixer al vi (Barata et al 2012).

Tornant a la possible microbiota específica del terroir, s’ha vist que alguns compostos volàtils que contribueixen a l’aroma del vi, com 2-metil-butanoic o 3-metil-butanol, són produïts per microorganismes aïllats a les vinyes, com el bacteri grampositiu Paenibacillus, o el fong basidiomicet Sporobolomyces o l’ascomicet Aureobasidium. Per tant, podria haver una relació entre algunes de les espècies microbianes trobades a la vinya i alguns aromes detectats al vi, procedents del most, és clar (Verginer et al 2010).

La metagenòmica com a eina analítica de la microbiota dels raïms

Donat que els mètodes clàssics d’aïllament i cultiu dels microorganismes són lents, laboriosos i alguns dels microbis no s’aconsegueix fer-los créixer en els medis d’aïllament, actualment es recorre als mètodes de seqüenciació massiva o metagenòmica. Aquests consisteixen en analitzar el DNA present i a partir de les seqüències, deduir amb les bases de dades quins són els microorganismes presents a la mostra. En el cas dels bacteris sovint s’utilitza el DNA amplificat del fragment V4 del gen 16S RNA (Caporaso et al 2012).

S’ha utilitzat en mostres de vins botrititzats (Bokulich et al 2012) i s’han trobat proporcions de diversos bacteris làctics (però no Oenococcus), inclosos alguns no associats normalment a vi. També s’ha utilitzat per veure la microbiota resident als cellers i com canvia segons les estacions, comprovant que a les superfícies dels dipòsits i maquinària del celler hi ha una majoria de microorganismes no relacionats amb el vi ni tampoc perjudicials (Bokulich 2013).

Amb aquesta tècnica Bokulich et al (2014) també han analitzat els raïms i han vist diferències clares entre les proporcions dels diversos grups bacterians (i de fongs) entre diferents llocs, diferents varietats, i també segons les condicions ambientals o biogeogràfiques. Per exemple, en analitzar 273 mostres de mostos de raïms de Califòrnia, les 3 varietats (Cabernet, Chardonnay i Zinfandel) queden bastant discriminades en una anàlisi de components principals respecte a les comunitats bacterianes trobades a cada mostra (Figura 2).

Així doncs, els grups o taxons bacterians dominants en una varietat o ambient determinat podrien aportar unes característiques específiques en aquells vins, i això podria explicar alguns patrons regionals o de terroir en les propietats organolèptiques d’aquests vins (Bokulich et al 2014).

Fig 2 ACP Bokulich 2014

Figura 2. Anàlisi de components principals de les comunitats bacterianes de mostres de mostos de raïms de Sonoma (Califòrnia) de 3 varietats diferents (Cabernet en vermell, Chardonnay en verd i Zinfandel en blau) (Bokulich et al 2014).


Nosaltres també hem realitzat un estudi de seqüenciació massiva amb les mostres de raïms de les quals hem obtingut aïllats d’O. oeni, com he comentat abans (Franquès et al 2015), i en més 600.000 seqüències del rRNA 16S analitzades hem trobat sobretot Proteobacteris i Firmicutes. Entre aquests grampositius, hem trobat seqüències de bacteris làctics (un 15%) i d’aquests hem pogut confirmar amb èxit la presència d’O. oeni en un 5% de les seqüències. Per tant, hem aïllat O. oeni dels raïms i n’hem detectat el seu DNA en força mostres.

La microbiota bacteriana de tota la vinya i del sòl

Com veiem, s’ha estudiat una mica la microbiota dels raïms i dels vins, però molt menys la microbiota dels sòls, la qual pot definir més bé el terroir, que està influït pel clima local i les característiques de la vinya.

Veiem a la Figura 3 un resum dels principals gèneres trobats a les diferents parts de la vinya i al sòl (Gilbert et al 2014).

Fig 3 Gilbert 2014

Figura 3. Principals bacteris i fongs associats als òrgans i sòl de Vitis vinifera (Gilbert et al 2014)


Recentment s’ha publicat un treball interessant (Zarraonaindia et al 2015) sobre aquest tema, amb l’objectiu de veure si el sòl podria ser la principal font de bacteris que colonitzen els raïms. Han agafat mostres de sòl, arrels, fulles, raïms i flors de Merlot, de diferents terrenys i anys, de Suffolk, Nova York, i n’han analitzat el DNA dels bacteris presents mitjançant seqüenciació del 16S rRNA. Han trobat que un 40% de les espècies trobades són presents a totes les mostres de sòls i arrels, mentre que en fulles i fruits hi ha més variabilitat, i a més un 40% de les trobades en fulles i fruits també apareixen a les mostres de sòls. Tot plegat suggereix que molts dels bacteris s’originen al sòl.

En quant als tipus de bacteris presents, com veiem (Figura 4), predominen els Proteobacteris (sobretot Pseudomonas i Methylobacterium), principalment a les parts aèries de la planta. També hi han Firmicutes lògicament, i Acidobacteria i Bacteroides.

Fig 4 microbiota vineyard

Figura 4. Composició de la comunitat bacteriana, a nivell taxonómic de fílum, en mostres de diferents òrgans de la vinya i el seu sòl (Zarraonaindia et al 2015).


Encara que s’observen variacions en totes les mostres en funció de l’any (poden tenir diferents condicions climàtiques) i en funció de factors edàfics diferents (pH, C:N, humitat), com veiem (Figura 5) les anàlisis de components principals demostren que els tipus de mostres (sòl, arrels, fulles, raïms) es diferencien força bé, i mostres de mostos abans de fermentar queden semblants a les de raïms.

Fig 5 distribució grups mostres OTUs

Figura 5. Anàlisi de components principals mostrant les semblances en quant a la composició dels grups taxonòmics presents, entre tots els tipus de mostres, incloent-ne de mostos (Zarraonaindia et al 2015).


Això suggereix que la comunitat bacteriana present als raïms roman relativament estable fins al most, i si més no, més estable que les diferències entre òrgans. Al mateix temps, una part important dels representants dels fílums bacterians dels raïms vindrien del sòl. Això es pot explicar perquè en fer la verema manual els raïms sovint són situats en caixes que es deixen a terra, o bé si es fa verema mecànica, la maquinària utilitzada remou el terra i genera pols, que pot colonitzar els raïms.

Per tant, la microbiota del sòl és una font de bacteris associats a la vinya i pot tenir un paper en el most, i per tant en la vinificació, i potencialment en la formació de les característiques del terroir. Alguns d’aquest bacteris poden tenir papers no coneguts de productivitat o de resistència a malalties de la planta, o contribuir a les característiques organolèptiques del vi (Zarraonaindia et al 2015).

A banda d’això, i pensant en els microorganismes vínics, responsables de les fermentacions, com he comentat, al nostre laboratori hem pogut confirmar que als raïms hi ha algunes soques d’Oenococcus oeni i ho hem corroborat amb la detecció del seu DNA als mateixos raïms.


Bibliografia

Bae S, Fleet GH, Heard GM (2006) Lactic acid bacteria associated with wine grapes from several Australian vineyards. J Appl Microbiol 100, 712-727

Barata A, Malfeito-Ferreira M, Loureiro V (2012) The microbial ecology of wine grapes (Review). Int J Food Microbiol 153, 243-259

Bokulich NA, Joseph CML, Allen G, Benson AK, Mills DA (2012) Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine. Plos One 7, e36357

Bokulich NA, Ohta M, Richardson PM, Mills DA (2013) Monitoring seasonal changes in winery-resident microbiota. Plos One 8, e66437

Bokulich NA, Thorngate JH, Richardson PM, Mills DA (2014) Microbial biogeography of wine grapes is conditioned by cultivar, vintage, and climate. PNAS nov 25, E139-E148

Caporaso JG, Lauber CL, Walters WA, Berg-Lyons D, Huntley J, Fierer N, Owens SM, Betley J, Fraser L, Bauer M, Gormley N, Gilbert JA, Smith G, Knight R (2012) Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J 6, 1621–1624

Franquès J, Araque I, Portillo C, Reguant C, Bordons A (2015) Presence of autochthonous Oenococcus oeni in grapes and wines of Priorat in South Catalonia. Article en elaboració.

Garijo P, Lçopez R, Santamaría P, Ocón E, Olarte C, Sanz S, Gutiérrez AR (2011) Eur Food Res Technol 233, 359-365

Gilbert JA, van der Lelie D, Zarraonaindia I (2014) Microbial terroir for wine grapes. PNAS 111, 5-6

Renouf V, Claisse O, Lonvaud-Funel A (2005) Understanding the microbial ecosystem on the grape berry surface through numeration and identification of yeast and bacteria. Aust J Grape Wine Res 11, 316-327

Renouf V, Claisse O, Lonvaud-Funel A (2007) Inventory and monitoring of wine microbial consortia. Appl Microbiol Biotechnol 75, 149-164

Sieiro C, Cansado J, Agrelo D, Velázquez JB, Villa TG (1990) Isolation and enological characterization of malolactic bacteria from the vineyards of Northwestern Spain. Appl Environ Microbiol 56, 2936-2938

Verginer M, Leitner E, Berg G (2010) Production pf volatile metabolites by grape-associated microorganisms. J Agric Food Chem 58, 8344-8350

Tenim clostridis bons al budell i alguns eviten les al·lèrgies

 Click here for the english version: We have good clostridia in the gut and some of them prevent allergies 

1 març 2015

Clostridis: qui són ?

Els clostridis o clostridials, amb el gènere Clostridium i altres relacionats, són bacteris grampositius esporulats anaerobis estrictes, del fílum taxonòmic Firmicutes. Aquest fílum inclou a més dels clostridis, els aerobis esporulats bacil·lals (Bacillus, Listeria, Staphylococcus i altres) i els anaerobis aero-tolerants lactobacil·lals (o sigui els meus amics bacteris làctics: Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus etc). Tots els Firmicutes tenen formes regulars de coc o bacil i constitueixen la branca evolutiva de bacteris grampositius amb contingut baix de G+C al seu DNA. L’altra gran branca evolutiva de bacteris grampositius són els Actinobacteris, d’alt G+C i de formes més irregulars, que inclou Streptomyces, Corynebacterium, Bifidobacterium i Propionibacterium entre altres.

flora_cover

 

 

Com són anaerobis, els clostridis tenen un metabolisme fermentatiu, tant de carbohidrats i d’aminoàcids, essent els principals responsables de la descomposició anaeròbica de les proteïnes, coneguda com a putrefacció. Poden viure en hàbitats molt diversos, però sobretot al sòl i sobre material vegetal i animal en descomposició. Com veurem tot seguit, també formen part de la microbiota intestinal humana i d’altres vertebrats.

Els clostridis més coneguts són els dolents (Figura 1): a) C. botulinum, que produeix la botulina del botulisme, encara que avui dia té aplicacions mèdiques i cosmètiques, com sabeu (Botox); b) C. perfringens, agent de la gangrena; c) C. tetani, que causa el tètanus; i d) C. difficile, causa de diarrea postantibiòtica i algunes colitis hospitalàries.

clostridium_bacteria

Figura 1. Les 4 espècies més patògenes de Clostridium. Imatge treta de http://www.tabletsmanual.com/wiki/read/botulism

 

Clostridis a la microbiota intestinal

Tal com comentava a un post anterior (Bacteris de l’intestí ……) d’aquest mateix blog, al tracte gastrointestinal humà hi ha un ecosistema complex, i divers segons els individus i l’edat, amb un total de 1014 microorganismes. La majoria d’aquests són bacteris, a banda d’alguns arquees metanògens (un 0.1%) i algun eucariota (llevats i fongs filamentosos). Quan es fan aïllaments clàssics microbiològics a partir de mostres del colon i es cultiven els aïllats s’obtenen unes 400 espècies microbianes i els grups més assenyalats són proteobacteris (sobretot enterobacteris, com E. coli), firmicutes com Lactobacillus i alguns Clostridium, actinobacteris com Bifidobacterium, i alguns Bacteroides. Entre tots aquests aïllats s’han reconegut alguns amb efecte positiu sobre la salut i que són emprats com a probiòtics, com Bifidobacterium i Lactobacillus, bacteris considerats GRAS (Generally Recognized As Safe).

Però des de fa uns 10 anys les tècniques moleculars independents de cultiu, de seqüenciació dels gens del RNA ribosomal, han revelat moltes més espècies, arribant a ser unes 1000. Com veiem a la Figura 2, treta de la bona revisió de Rajilic-Stojanovic et al (2007), hi ha dos grups que tenen molts més representants dels que es pensava: Bacteroides i els clostridials.

 

Rajilic 2007 Fig 1

 

Figura 2. Arbre filogenètic basat en les seqüències gèniques del 16S rRNA dels diversos filotipus trobats al tracte gastrointestinal humà. La proporció de filotipus cultivables o no cultivables de cada grup està representada pel color des del blanc (cultivables) passant pel gris fins al negre (no cultivables). Per a cada grup filogenètic s’indiquen el nombre de filotipus diferents (Rajilic-Stojanovic et al 2007)

 

En estudis més recents relacionats amb la dieta com el fet per Walker et al (2011) amb mostres fecals de voluntaris s’han estimat les poblacions dels diversos grups mitjançant PCR quantitativa del DNA del 16S rRNA. Els grups més nombrosos, amb un 30% cadascun, han estat Bacteroides i els clostridials. Entre aquests destaquen Faecalibacterium prausnitzii (11%), Eubacterium rectale (7%) i Ruminococcus (6%). Com veiem el grup dels clostridials inclou nombrosos gèneres diferents del conegut Clostridium.

De fet, si considerem la població de cada espècie present al tracte gastrointestinal humà, la més abundant sembla ser un clostridial: F. prausnitzii (Duncan et al 2013).

 

Beneficis d’alguns clostridials

Aquests darrers anys s’ha anat veient que precisament són algunes espècies de clostridials, del gèneres Faecalibacterium, Eubacterium, Roseburia i Anaerostipes (Duncan et al 2013), les que més contribueixen a la producció dels àcids grassos de cadena curta (AGCC, SCFAs en anglés) al colon. Els clostridials fermenten els carbohidrats de la dieta que s’escapen de la digestió produint els AGCC, bàsicament acetat, propionat i butirat, que es detecten a la femta (50-100 mM), i que són absorbits a l’intestí. L’acetat és metabolitzat sobretot pels teixits perifèrics, el propionat és gluconeogènic, i el butirat és la principal font d’energia de l’epiteli del colon. Els AGCC en total arriben a ser el 10% de l’energia obtinguda per l’hoste humà. Alguns d’aquests clostridials com Eubacterium i Anaerostipes també utilitzen com a substrat el lactat produït per altres bacteris com els làctics i Bifidobacterium, per produir igualment els AGCC (Tiihonen et al 2010).

 

Els clostridis de la microbiota protegeixen de la sensibilització per al·lèrgens dels aliments

Efectivament, això és el que han demostrat Stefka et al (2014) en un recent treball excel·lent, com a darrera troballa dels aspectes positius dels clostridis de la microbiota. En administrar al·lèrgens (Ara h) del cacauet (Arachis hypogaea) a ratolins que havien estat tractats amb antibiòtics o a ratolins sense microbiota (Germ-free, criats en ambient estèril), observaven que hi havia una hiperreactivitat al·lèrgica sistèmica, amb inducció de immunoglobulines específiques, o sigui, una sensibilització.

En els ratolins tractats amb antibiòtics s’observava una reducció significativa de la microbiota en el nombre de bacteris (analitzant els gens del 16S rRNA) a l’íleon i a la femta, i a més s’alterava la biodiversitat, de tal manera que els Bacteroides i clostridials predominants en condicions normals quasi desapareixien i en canvi augmentaven només els lactobacils.

Per veure el paper d’aquests grups predominants a la microbiota, Stefka et al. van colonitzar l’intestí de ratolins sense microbiota amb Bacteroides, i altres amb clostridis. Això és el que se’n diuen animals gnotobiòtics, o sigui animals dels que se sap exactament quins tipus de microorganismes contenen.

Doncs bé, Stefka et al. han demostrat que la colonització selectiva de ratolins gnotobiòtics amb clostridis els confereix una protecció enfront els al·lèrgens del cacauet, cosa que no passa amb Bacteroides. Per a la colonització amb clostridis, van utilitzar una suspensió d’espores extretes de mostres fecals de ratolins sans, i van confirmar que les seqüències gèniques d’aquest extracte corresponien sobretot a membres dels clostridials.

Així doncs, en efecte, els ratolins colonitzats amb clostridis presentaven menors nivells de l’al·lergen al sèrum (Figura 3), tenien menor contingut d’immunoglobulines, no hi havia inflamació del cec, i la temperatura corporal es mantenia. Els ratolins tractats amb antibiòtics que havien presentat la reacció hiperal·lèrgica en administrar-los els antígens també reduïen la reacció en colonitzar-los amb els clostridis.

 

fig 4 skefta

Figura 3. Nivells de l’al·lergen “Ara h” del cacauet en sèrum després de la ingesta de cacauets, en ratolins sense microbiota (Germ-free), colonitzats amb Bacteroides (B. uniformis) i colonitzats amb clostridis (Clostridia). Tret de Stefka et al (2014).

 

A més, en aquest treball exhaustiu, Stefka et al. han realitzat una anàlisi transcriptòmica amb microarrays de les cèl·lules de l’epiteli intestinal dels ratolins i han trobat que els gens de producció de la citoquina IL-22 estan induïts als animals colonitzats amb clostridis, i que aquesta citoquina redueix la captació de l’al·lergen per part de l’epiteli i per tant n’evita l’entrada a la circulació sistèmica, contribuint també a la protecció enfront la hipersensibilització. Tots aquests mecanismes han estat revisats per Cao et al (2014) i en veiem un esquema a la Figura 4.

En conclusió, amb això s’obren noves perspectives d’estudis per prevenir les al·lèrgies alimentàries mitjançant la modulació de la composició de la microbiota intestinal. Tot plegat, afegint aquestes qualitats antiinflamatòries a més de les esmentades de producció de butirat i altres AGCC, i del consum de lactat, caldrà anar pensant en la possible utilització de clostridials per a candidats com a probiòtics, a banda dels reconeguts Lactobacillus i Bifidobacterium.

 

fig 4 Cao b

 

Figura 4. Esquema de la inducció dels clostridis sobre la producció de citoquines per les cèl·lules epitelials de l’intestí, així com la producció d’àcids grassos de cadena curta (SCFAs) pels clostridis (Cao et al 2014).

 

Bibliografia

Cao S, Feehley TJ, Nagler CR (2014) The role of commensal bacteria in the regulation of sensitization to food allergens. FEBS Lett 588, 4258-4266

Duncan SH, Flint HJ (2013) Probiotics and prebiotics and health in ageing populations. Maturitas 75, 44-50

Rajilic-Stojanovic M, Smidt H, de Vos WM (2007) Diversity of the human gastrointestinal tract microbiota revisited. Environ Microbiol 9, 2125-2136

Rosen M (2014) Gut bacteria may prevent food allergies. Science News 186, 7, 4 oct 2014

Russell SL, et al. (2012) Early life antibiotic-driven changes in microbiota enhance 
susceptibility to allergic asthma. EMBO Rep 13(5):440–447

Stefka AT et al (2014) Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Nat Acad Sci 111, 13145-13150

Tiihonen K, Ouwehand AC, Rautonen N (2010) Human intestinal microbiota and healthy aging. Ageing Research Reviews 9:107–16

Walker AW et al (2011) Dominant and diet-responsive groups of bacteria within the human colonic microbiota. The ISME J 5, 220-230

No sé ni cómo te atreves

Fotografía y esas pequeñas cosas de cada día

Pols d'estels

El bloc d'Enric Marco

Life Secrets

For my students

Horitzons llunyans

Mirades distants

#4wine

Los vinos son pequeñas historias dentro de una botella y nosotras queremos contarte las nuestras

Vi·moments·persones

Un maridatge a tres bandes

SciLogs: Artificial, naturalmente

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

microBIO

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

RealClimate

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

Quèquicom

Coses interessants de ciències de la vida i de la natura, i altres no tan "Bios"

Dionís de viatge a Ítaca

Experiències enoturístiques

%d bloggers like this: